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(無題) 削除/引用 No.12363-16 - 2024/06/11 (火) 23:54:15 - rakkyo 皆様ご助言ありがとうございました。 何人かの方がおっしゃる通りRoxの設定の問題でした。Roxの設定を無としたところ解決しました。 かなり基本的なことでお騒がせしてしまいお恥ずかしいですが、論文等でよく見る増幅曲線が見られて非常に嬉しいです。 ご助言くださった皆様誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12363-15 - 2024/06/11 (火) 22:25:36 - おお ああ、なるほど。確かにROX補正をしようとしていたら変になるかもですね。

(無題) 削除/引用 No.12363-14 - 2024/06/11 (火) 21:39:58 - と 私もROX補正の設定かと思いました。 ROXを入れていないなら、アプリケーションのROX補正をオフにしてみてください。

(無題) 削除/引用 No.12363-13 - 2024/06/11 (火) 20:25:45 - Rox qPCRマシンのテクニカルサポートに聞いた方が確実だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12363-12 - 2024/06/11 (火) 20:20:56 - Rox SYBR Greenも加えて。自作mixでもうまく行くと聞いて試したのですが。

(無題) 削除/引用 No.12363-11 - 2024/06/11 (火) 20:13:45 - Rox 前にHS taqにROXを加えて自作qPCRをしたとき、がたがたの増幅曲線が得られました。産物は特異的なんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.12363-10 - 2024/06/11 (火) 14:14:31 - おお >[Re:4] rakkyoさんは書きました : > ご返信ありがとうございます。 > 最初のリンクの初期のサイクルのような状況が延々と続く感じです（心電図のよう）。そのため、Ct値の計算も全くできないような状況です。 じゃあプライマーかプローブどちらかがワークしてないです。それかRNAが壊れていたか、RTに問題があったか。 電気泳動で確かめるのは常套手段ですが、一本きれいに大体予測通りのバンドが出ても、スペシフィックと確実に言えるわけではありません。 Multicomponent plotで蛍光が上昇しているとして蛍光強度としてはワークしたとき見られるほど十分な強度が得られているのでしょうか？ また１００ngって相当な量なので下手したら測れないぐらい多いような気がしますよ。測れたとしてかなり早いサイクルで立ち上がって、サチュレーションしてしまうのが見れるぐらいの量だと思います。それがダラダラと上がっているならやはりアンプリコンが増幅してないか、していてもプローブがちゃんと認識してないのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.12363-9 - 2024/06/11 (火) 12:26:23 - rakkyo >[Re:8] nonameさんは書きました : > 意外と見落としがちなのが、ROXの設定とか ご返信ありがとうございます。Roxは使用していないのですが、Roxの設定でΔRnが大きく変わるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12363-8 - 2024/06/11 (火) 11:26:45 - noname 意外と見落としがちなのが、ROXの設定とか

(無題) 削除/引用 No.12363-7 - 2024/06/11 (火) 09:26:52 - rakkyo >[Re:5] ろろろさんは書きました : > cDNAちゃんと入れてますか？ Onestep RT-qPCR kitを使用しているため、問題ないはずです。

(無題) 削除/引用 No.12363-6 - 2024/06/11 (火) 09:25:35 - rakkyo あのさん ご返信ありがとうございます。 他の標的遺伝子で実験した際は、問題なく増幅しているため、プレートは問題ないかもしれません。しかし、そういうこともあるのですね。ご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12363-5 - 2024/06/11 (火) 09:25:34 - ろろろ cDNAちゃんと入れてますか？

(無題) 削除/引用 No.12363-4 - 2024/06/11 (火) 09:22:39 - rakkyo ご返信ありがとうございます。 最初のリンクの初期のサイクルのような状況が延々と続く感じです（心電図のよう）。そのため、Ct値の計算も全くできないような状況です。

(無題) 削除/引用 No.12363-3 - 2024/06/11 (火) 06:26:03 - あの 一度だけ、ガタガタになったことがあって、その時の原因は、 純正でないプレートの使用でした。

(無題) 削除/引用 No.12363-2 - 2024/06/11 (火) 01:33:00 - おお https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/understanding-ct-values/ このページの最初の図のような感じですか、数値的には蛍光強度なのでなんとも言えませんし、軸の取り方でも印象が違うでしょうけど。 https://www.youtube.com/watch?v=5BjFAJHW-bE こちらに解説もありますね。うーんだいたい１００倍のレンジで上下してますかね。たしかこの上下しているあたいのSDをとってそのSDの１０倍の値をCt値の閾値に使っていたかとおもいます。

RT-qPCRの増幅曲線がガタガタになります 削除/引用 No.12363-1 - 2024/06/10 (月) 22:37:26 - rakkyo 初めまして。現在Taqman法によるRT-ｑPCR実験を行っています。 Templateには、In vitro合成RNAの10fg~100ngまで段階希釈したものを、蛍光色素はFAMを用いています。TAKARAのPrimeScriptを用いて何度か実験を行ったものの、Amplification plot（縦軸:ΔRn/ 横軸：サイクル数）がガタガタになります。具体的にはサイクル数10回以下のところでΔRnが10000程度まで上がり、またすぐに10まで下がり、また10000程度まで上がるというような感じです。一方で、Multicomponent plot（縦軸：蛍光の絶対量/横軸: サイクル数）を確認すると、テンプレート濃度順になだらかな曲線が立ち上がっており、プローブは機能していそうなことを確認できました。 また、RT-qPCR後の産物を電気泳動したところ、目的の増幅産物が確認できており、プライマーの特異性も問題がなさそうです。にもかかわらずなぜ増幅曲得がガタガタになってしまうのでしょうか。 qPCRは今回がはじめてで周囲にも慣れている人がおらず困っております。 拙い質問で恐縮ですが、何か原因がわかる方がいらっしゃいましたらご教示いただけますと幸いです。何卒宜しくお願い致します。

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