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(無題) 削除/引用 No.12360-15 - 2024/06/08 (土) 18:06:12 - おお High Resolutionとかで検出しているならHigh Binningもーどにしていちど見てみてもいいかもしれません。見えなかったものが、検出感度を上げる事で見える事があります。 違うイメージャーですが、ポスドクに私が使っているデフォルトの設定(binningによる感度調整の設定)を教えたのに、Resolutionを数段階上げて、バンドが見えないとか言ってきた事が有ります。binning から説明する羽目になった。 あと、検出は当たり前ですがカメラに近い方がいいので設定できる一番上にステージを上げてください。露光時間も見えなかったら、5倍ぐらい長い設定も試すべきですが、その辺はどうしてますか。 得られて画像は完璧に真っ白ですか？何かばっくぐらんどの薄らとしたシグナルは見えてませんか？

(無題) 削除/引用 No.12360-14 - 2024/06/08 (土) 17:43:19 - おお >[Re:13] neruneさんは書きました : > みなさま、ありがとうございます > これは、やはり抗体反応の部分に問題があるという理解であっていますでしょうか。 それをあなたが突き止めないと解決できない可能性がたかいです。皆さんが自身の経験や知識から助言をしている訳で、それを全部書き出せとまで言わないけど、出来そうなとこらから潰して絞り込むしかないでしょう。研究ではいつもそう言う事がつきまとうもんです、基本的なテクニックにしろ、もっと高いレベルの事であっても。 後、使っているバッファーも間違えるはずがないとか、そう言うとこに目がいかない事も多いけど、一度作り方や量など確認しながら作り直すのもやってみるといいと思う。 サンプリングの問題や、オーバーロード、その他の理由でサンプルが綺麗に流れてないなども要因になる場合もある。

(無題) 削除/引用 No.12360-13 - 2024/06/08 (土) 13:53:08 - nerune みなさま、ありがとうございます。 他のラボでWBを見せてくれる方、相談に乗ってくれる方を探してみます。 何もバンドが見えないときは、マーカーすら見えていません。しかし、有色マーカーを使用しているので、転写されていることは確認しています。 これは、やはり抗体反応の部分に問題があるという理解であっていますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12360-12 - 2024/06/08 (土) 10:08:45 - もも 私はブロッキングに一次抗体を足して使っています。一次抗体は二次ほどくっつかないのでTweenを抜くことも。 抗体はどのように保存していますか？冷凍解凍を繰り返すと一次抗体は劣化することがあるので、冷凍庫保存の場合、私は少量に分けて保存しています。 抗体のテストとして細胞ライセート（５uLほど）をそのままメンブレンに落とし、その上に一次抗体を乗せ、ECLで反応を見るというドットブロットがあります。組み合わせによってどの抗体が問題なのかわかったりしますよ。

(無題) 削除/引用 No.12360-11 - 2024/06/08 (土) 03:15:00 - E > 今まで一次抗体、二次抗体共にTBSTのみで希釈していたのですが、これがWBが安定しない要因なのでしょうか。（セルシグナリングの抗体を使用しています。企業推奨の希釈液は、5%BSA/TBSTです。） うちでもCST社の抗体はよく使います。うちではこのようにやっています。 ブロッキング；5%ミルク/TBST（ブロッキングが終わったら取っておいて二次抗体反応に再利用する。） 一次抗体 (1/1000)；5%BSA/TBST（オーバーナイト） 二次抗体 (1/5000)；5%ミルク/TBST（ブロッキングで使ったものに二次抗体を入れて再利用。二次抗体反応が終わったら捨てる。）

(無題) 削除/引用 No.12360-10 - 2024/06/08 (土) 01:06:53 - おお ところで、WBをしているのはあなたのラボであなただけですか？実際に現場にいる人のほうが原因を見つけれる精度が高いはずです。また、近くのラボでWBをしているなら相談してみる、手元の抗体を使ってもらって良し悪しをさぐる。１回分でいいから抗体など使わせてもらう。実際にそのラボで手際を見せてもらうなどできなくもないはずです。 ここで聞いても大体一般的なトラブルシューティングの話と大差ないことも多いだろうし、そんなこともあるのかと感心することもまあまああるにしても、あなたのケースでは的外れだったりすることもあるので、ワークしているところ、ひと、と情報交換したりやっているところを見てもらったり、ワークしている系をつかわせてもらったりしたほうが可能性をしぼれる効率が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12360-9 - 2024/06/08 (土) 00:56:55 - おお >セルシグナリングの抗体を使用 セルシグナリングの二次抗体はー２０で数年安定しているようです。セルシグナリングにかえて１年ぐらい経っているかな。。。ちゃんとワークしています。一応お使いのロットなどでワークしなかったという報告がセルシグナリングに上がってないか聞いてみてもいいかもしれません。原因がわからずともほんとにお手元のものがワークしない状態が明らかなら代替え品（違うロット）を送ってくれたという話を最近聞きました。

(無題) 削除/引用 No.12360-8 - 2024/06/07 (金) 23:58:20 - おお 抗体反応液に私はブロッキング剤を入れてます、PVPですけど。BSAでも構わないですが。ブロッキング剤を入れないプロトコールも見た事がありますのでこの事が原因で大きな違いが出るかというと微妙。 で、バックが黒くなったりですが、原因解明のため、コントラストなどオートで調整しないようにするか、調整済みでも解除できるようなデーターなら解除してみてください。 2時抗体のHRP活性は大丈夫なのだろうか。。。商品によっては数ヶ月でへたる。

(無題) 削除/引用 No.12360-7 - 2024/06/07 (金) 23:35:45 - たこ CSTのやつはデータシートに書かれている通りにやらないと汚いデータになるということは何回か経験しました。 ですので、少なくともCSTの抗体はそうするのが安牌だとおもいます。 私はLLLLさんとは違って全ての抗体希釈にBSAやらタンパク質性のものはつっこんで無いですがね。 オーバーマスクされることもあるので。

(無題) 削除/引用 No.12360-6 - 2024/06/07 (金) 22:29:42 - nerune LLLLさん > 抗体希釈液は必ず１~5%程度のタンパク質（BSA、フィッシュゼラチンもしくはスキムミルクなど）を含むbufferを使用してください。 > ていうか面倒ならblocking bufferを流用していいです。私たちは抗体反応では3%BSA/TBS/0.05% Tween20を使用しています。TBSでなくPBSでもいいです。ただ（セリン）リン酸化修飾formに対する抗体の場合はスキムミルクやPBSは避けてください。濃度についてはあまり高いと抗体反応がやや減弱するようなことがあったので3%くらいでやってます。・・・ こんなにも詳しく教えていただき、本当にありがとうございます。 バンドが出たりでなかったりしていたのは、運よく抗体が吸着しなかったときにバンドが見えていただけなのかもしれません。それに、一次抗体や二次抗体をTBSTで希釈していたので、それが一種の洗浄になりブロッキングをはがしていたのかもしれません。 ブロッキング剤（5%BSA/TBST/0.1%Tween20）で希釈してみます。

(無題) 削除/引用 No.12360-5 - 2024/06/07 (金) 22:13:53 - LLLL 抗体希釈液は必ず１~5%程度のタンパク質（BSA、フィッシュゼラチンもしくはスキムミルクなど）を含むbufferを使用してください。 ていうか面倒ならblocking bufferを流用していいです。私たちは抗体反応では3%BSA/TBS/0.05% Tween20を使用しています。TBSでなくPBSでもいいです。ただ（セリン）リン酸化修飾formに対する抗体の場合はスキムミルクやPBSは避けてください。濃度についてはあまり高いと抗体反応がやや減弱するようなことがあったので3%くらいでやってます。 抗体反応液については、希釈することで抗体は超低濃度になります。このような状態で他にタンパク質がないと抗体分子は容器や膜表面などいろんなとこに容易に非特異的に吸着して、失活したりロスしてしまう割合が格段に増えます。他のタンパク質が充分量共存することで、吸着ロスが抑えられ抗体は超低濃度でも安定に存在して働くことができるのです。 メンブレンはすでにブロッキングをしているといっても、bufferで洗浄するとブロッキングタンパク質は膜から相当部分取れてしまいます（電気的に引っ張るブロッティングで強制的に吸着させた場合と違い、ただタンパク質溶液につけただけではタンパク質はそんなにしっかりくっついてません）。ですので相応の高濃度のBSAなどの不活性共存タンパク質がないと、元々スティッキーな性質のある抗体分子（特に変性しかかった抗体）は膜表面に非特異的に吸着したりする恐れがあります。もちろん吸着の多い少ないは抗体の状態やブロッキングの取れ具合など諸条件により変わるでしょうが、お示しの反応条件ですとこうしたことがバックグラウンドを高くしているような気がします。 市販の抗体溶液にもBSAなどが安定化のためのキャリアタンパク質として一定濃度添加されているのは吸着などの問題を避けるためです。抗体に限らず、生物活性のあるタンパク質を、安定化の方策を講じることなく低濃度の溶液状態のまま長くおくことは当該タンパク質にとっては決して好ましいことではありません。

(無題) 削除/引用 No.12360-4 - 2024/06/07 (金) 21:28:06 - aa 関係なければよいのですが... 例えばリン酸化されているタンパク質を見ようとしてリン酸化○○の抗体を使用する際は、ブロッキングにスキムミルクを使用することはあまり推奨されていません スキムミルク中のカゼインに反応して、バックグランドが高くなりますよ

(無題) 削除/引用 No.12360-3 - 2024/06/07 (金) 21:09:57 - nerune >[Re:2] あのさんは書きました : > まず対象について、もう少し情報ください > > ヒトとか、マウスやラットのようなモデル動物で > > 既報で使用実績のある抗体ですか？ ご返信ありがとうございます。 ヒトの上皮培養細胞を使用しています。 セルシグナリングのb-actinも使用抗体の一つであるため、使用実績のあるものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.12360-2 - 2024/06/07 (金) 20:43:21 - あの まず対象について、もう少し情報ください ヒトとか、マウスやラットのようなモデル動物で 既報で使用実績のある抗体ですか？

抗体希釈液について【WB】 削除/引用 No.12360-1 - 2024/06/07 (金) 20:31:47 - nerune 初めまして。 以前にトピックでWBのトラブルシューティングについて質問させていただき、皆さまからアドバイスを頂いた通りにWBを行ってみたのですが、それでも上手くいかなかったため再度トピックを立てさせていただきます。 （自分の技量不足だと思います。アドバイスをくださった皆様にはとても感謝しております。本当にありがとうございます。） 以下、質問です。 WBが安定しないことで悩んでいます。バックが高く、メンブレンが真っ黒になってしまったり、逆に何もバンドが見えないこともあります。しかし、綺麗にバンドが見えるときもあり安定しません。ポンソーSなどで転写まで上手くいっていることは確認しています。 今まで一次抗体、二次抗体共にTBSTのみで希釈していたのですが、これがWBが安定しない要因なのでしょうか。（セルシグナリングの抗体を使用しています。企業推奨の希釈液は、5%BSA/TBSTです。） 何かアドバイスやご意見などありましたら、教えていただきたいです。 よろしくお願いいたします。

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