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(無題) 削除/引用 No.12357-19 - 2024/06/07 (金) 09:51:04 - おお 免疫染色には使ったことがないですねぇ。。。頻繁にIFなどやっている人の意見が聞けるといいのですが、、、 PVP３６０kなどはIn situ hybridizationなどのプロトコールで見ることがあります。

(無題) 削除/引用 No.12357-18 - 2024/06/07 (金) 09:28:29 - あの おおさん それから0.5〜1%のPVP液を、免疫染色に使ったことありますか？ 当方では正常ヤギ血清（第２抗体はヤギIgGなので）を使っているのですが、年々、値上がりしてきていて、代替物を探しています。

(無題) 削除/引用 No.12357-17 - 2024/06/07 (金) 09:24:09 - おお TBSTを使ってます。Tween20は0.2%ですが結構いい加減です。PBSTは作ってしばらくおいておくと容器が曇ったりしてなにか不溶物が出てきたりもしましたのでTBSTに変更しました。その結果そういうのはなくなり１００mlほど作って別に何日でも保存可能です。この辺はちゃんと書いておくべきでした。

(無題) 削除/引用 No.12357-16 - 2024/06/07 (金) 09:10:50 - あの おおさん ”Mass specに持ち込み同定するのにも使われてます、、、蛋白性のブロッキングを使わず余分な物の検出を抑えるのにも有効” 重ねての情報ありがとうございます。 念のため確認ですが、ＷＢのブロッキングのために0.5〜1％程度にPVPを希釈する際のバッファーは何をお使いですか？ 界面活性剤が一切無い、PBSでよいですか？

(無題) 削除/引用 No.12357-15 - 2024/06/07 (金) 06:06:58 - おお >[Re:13] あのさんは書きました : > おおさん > > ありがとうございます ちなみに、PVPを使うのは自己抗体の抗原を検出するときなど、WBでその抗体が反応する部分の膜をMass specに持ち込み同定するのにも使われてます。蛋白性のブロッキングを使わず余分な物の検出を抑えるのにも有効です。

(無題) 削除/引用 No.12357-14 - 2024/06/07 (金) 04:36:03 - E > 洗浄バッファー50ml＋ミルク 2500g ミルクが2.5kg?

(無題) 削除/引用 No.12357-13 - 2024/06/06 (木) 12:03:58 - あの おおさん ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.12357-12 - 2024/06/06 (木) 09:42:32 - あああ 市販だとめちゃくちゃ高いので使いまわす気持ちはわかります。 簡単に作れます。 ノンファットミルク（スーパーなどの市販）＋洗浄バッファーです。 以下でできますよ〜 ⓵TBS 10Xの作製 Tris Base 12.1g Nacl 87.7g 水700ml pHを7.8に調整 水を再度加えて1000mlに ⓶TBST (洗浄バッファー) TBS10X 100ml 水 900ml Twin-20 100ul ⓷ブロッキングバッファー 洗浄バッファー50ml＋ミルク 2500g

(無題) 削除/引用 No.12357-11 - 2024/06/06 (木) 09:30:59 - signal みなさまご回答いただき、本当にありがとうございます。 ブロッキングは、市販のブロッキング粉末を溶かしたものを使用していました。カビなど目で見えるものはなかったのですが、使い回さないようにします。 二次抗体は、基本的に使いまわさない方が良いのですね。 二次抗体の反応時間を調節することは少し難しいので、まずは上記2点をフレッシュなものにして実験してみます。

(無題) 削除/引用 No.12357-10 - 2024/06/06 (木) 08:26:19 - あああ 映写時間などがわかりませんが、シグナル強度が低いから相対的にノイズが大きくなるからではないですか？ ブロッキング剤 →自作していれば、超安価なので1回で使い捨てで良いと思っています。 2次抗体 →基本1回しか使いません。使いまわしても1-2日以内で2回までにしています。 二次抗体の反応時間は室温で４時間ほど →個人的には、長すぎる二次抗体は過剰なバックグラウンドの原因だと理解しているのですが、他の皆さまの体験を見るに違うのですね。 1次抗体 →質問文に記載はないですが、正しく使えていますか？ 転写まではうまくいっている →バンドがほんのり見える程度ではないことや、バブルなどでバンドが消えていませんよね？

(無題) 削除/引用 No.12357-9 - 2024/06/06 (木) 08:13:28 - おお >PVPって、ポリビニルピロリドンですよね？ これに答えてなかったですね。。。そのとおりです。

(無題) 削除/引用 No.12357-8 - 2024/06/06 (木) 08:10:36 - おお PVP40で１％の濃度です。 ただ、ラボをゴゾゴゾしてたらPVP 360kが出てきまして用途もなく捨てるぐらいなら使えないだろうかと試した結果１％ぐらいできれいにブロッキングがかかっていたので（たぶん０.5%でもOKとおもう）、今はそれを使ってます。いちどPVP 360k１％にPVP40を０.5%加えてみたことがありますがたしかPVDF膜が半透明から真っ白になってシグナルが出なかったようなことがあったかと、はっきりした記憶ではないのですが、、、なので濃すぎると単にブロッキングがかかりすぎ以上の問題がありそうです。PVP40を０.5%から１％で自身のラボの環境で最適な濃度を決めてもいいのかもしれません。ちなみにこのくらいの濃度であればBSAを３％とか使うよりコストパフォーマンスがいいはずです。ミルクで腐ることがあるので変わりにどうしようかということで、コスパも考えてPVPを使う用になったというのが実際の経緯です。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/000326978690357X?via%3Dihub

(無題) 削除/引用 No.12357-7 - 2024/06/06 (木) 05:51:35 - あの おおさん 教えてください PVPって、ポリビニルピロリドンですよね？ 粉末から調整しているのですよね？ 調整時と使用時の濃度は何%ですか？ たぶん重合度の違う様々な商品があると思いますが、どれを使っていますか？

(無題) 削除/引用 No.12357-6 - 2024/06/06 (木) 01:20:34 - おお 多分他の方が指摘しているのと重なると思いますが、 スキムミルクは腐ります。自分で飲むために作ったものを冷蔵庫に保存したとして、何日後まで飲めるでしょうか？WBで室温とか（そうでなくても）いろいろな容器に入れたり戻したりしているので。 BSAなどを使う人もいますがやはり扱いによっては菌の繁殖はあるでしょう。炭素源になりますから。 私は合成ポリマーであるPVPをブロッキングに使ってます。can get signalもPVPベースだったと思います（PEGも若干入ってたかな）。 黒くなる原因は２つ（正反対の要因）あると思います。 ２次抗体が非特異的についてしまうばあい。膜が乾いてしまうとか、溶液の組成がいろいろな要因で変化したとかでしょうか。たまに２次抗体反応溶液をケチって部分的に乾いたりというのを見たことがあります。 Imagerがオートマティックにコントラストをつけるため（バックグランドのシグナルの一番高いところをマックスとして設定する？）全体が黒くなる。この場合は２次抗体がワークしてません。あるいは１次抗体がワークしてないので２次抗体がバックグランドだけを拾っている。 多分後者と思われます。２次抗体の使い回しはどうなんでしょうかねぇ。できなくはないですが限界がありますので、徐々に変になってくるし、安定しなくて当然と言われてしまえば、、、またアクチンなど非常に強いシグナルを拾ったあとの２次抗体は、その２次抗体溶液で他の膜を染めたときにアクチンのバンドが検出されてしまったりもする。 また、２次抗体のバックのシグナルで黒くなるようであれば２次抗体の濃度はあなたの検出系において高すぎるかもしれません。三倍ぐらい薄くてもいいかもよ。

(無題) 削除/引用 No.12357-5 - 2024/06/06 (木) 00:03:35 - SYBR master >[Re:1] neruneさんは書きました : > ・ブロッキング剤を３〜４回ほど使いまわしている。 えーっと、ブロッキング剤って、たぶんスキムミルクとかだよね、使い回ししたら雑菌繁殖していないの？以前(と言っても30年位前かな)、うちの後輩がブロッキング剤を発酵(いや腐敗で、そこそこ匂いしてました)させたことがありまして、結果がおかしくなったことがあります。そこ、使い回ししない方が良いです。 > ・二次抗体を３回ほど使いまわしている。 washはしていると思うけど、上記の液と同じ組成で使い回しているなら、止めた方が良いですね。 >[Re:1] neruneさんは書きました : > ・二次抗体の反応時間は室温で４時間ほど（授業の関係で１，２時間で止めることが出来ません。） >[Re:2] あのさんは書きました : > 3番目は原因ではないと思う。 あのさんも書いているけど、ここは多分影響少ないと思う。個人的には二次抗体いれたあとで、昼飯や夕飯食いに行ったことあるし、なんなら4度でover nightしたこともあった(金曜に放置して飲みに行って、月曜に確認したこともある)。

(無題) 削除/引用 No.12357-4 - 2024/06/05 (水) 23:05:14 - あの 想像ですが、HRPがヘタって、バンドのシグナルが弱くなって、バックとの差が小さくなっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.12357-3 - 2024/06/05 (水) 22:19:36 - nerune >[Re:2] あのさんは書きました : > 3番目は原因ではないと思う。 > > ブロッキング剤は、スーパーで買えるスキムミルクとかの安いもので、使い回さないようにして > > 二次抗体にHRPがついている系ですか？　そうなら、これが一番怪しい。 > > > ちなみに、東洋紡のcan get signal はオススメです。第一も第二も抗体の量を五分の1以上さらに薄められるので、ペイします。 あのさん ご返信ありがとうございます。 二次抗体はAnti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkeyというものを使用していて、HRP標識がされています。 ここが怪しいのは、HRPの効果？が薄くなってしまうからなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12357-2 - 2024/06/05 (水) 21:40:16 - あの 3番目は原因ではないと思う。 ブロッキング剤は、スーパーで買えるスキムミルクとかの安いもので、使い回さないようにして 二次抗体にHRPがついている系ですか？　そうなら、これが一番怪しい。 ちなみに、東洋紡のcan get signal はオススメです。第一も第二も抗体の量を五分の1以上さらに薄められるので、ペイします。

ウエスタンのトラブルシューティング 削除/引用 No.12357-1 - 2024/06/05 (水) 21:30:41 - nerune 初めまして。 現在WBを行っているのですが、たまにメンブレンが真っ黒になってしまうなど安定していません。以下３点について皆さんのご意見を伺いたいです。 ・（転写まではうまくいっていることをポンソーSや転写後のゲルで確認しています。） 以下、原因なのか？と思っている箇所３点です。 ・ブロッキング剤を３〜４回ほど使いまわしている。 ・二次抗体を３回ほど使いまわしている。 ・二次抗体の反応時間は室温で４時間ほど（授業の関係で１，２時間で止めることが出来ません。） 上記３点は、WBが安定しないことと何か関係があるのでしょうか。 拙い質問で大変申し訳ないのですが、アドバイスをいただければ幸いです。

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