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(無題) 削除/引用 No.12357-39 - 2024/06/11 (火) 22:22:12 - aqwsedrft 本当のところはよくわからないのですが、自動でシグナル強度を調整する機能とかが働くモードというかそういう検出機器だと、元々シグナルが弱くて、かつexposeの時間が短いと、そのものすごい弱いシグナルを検出できるように強引に感度が高くなり、その結果、前面真っ黒になることがありました。一応シグナルが普通に検出できるくらいまでexpose時間を延長するとそういうことは起こらなくなりました。 ブロッキング剤については防腐剤もしくはtween20などの界面活性剤を入れていないものは、保存しないほうがいいです。うちらは当日に用事調製して余りは捨ててます。冷蔵庫保存でも腐ったり沈殿したりします。作成後は１、2日中に使って余ったら捨てましょう。 ２次抗体の再利用も勧めません。抗体は結構丈夫ですが、酵素の方が失活してくることがあります。 反応時間は標準的な方法と比べると確かに長いですが、これ自体は今のトラブルの本質的な原因ではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12357-38 - 2024/06/10 (月) 22:18:06 - 杏里 >[Re:17] おおさんは書きました : > TBSTを使ってます。Tween20は0.2%ですが結構いい加減です。（中略）１００mlほど作って別に何日でも保存可能です。 Tween20は易分解性で、希釈して遮光せずに置いておくとdayオーダーで劣化しますよ。分解産物は酵素反応等を阻害するので要注意です。

(無題) 削除/引用 No.12357-37 - 2024/06/08 (土) 08:02:19 - あの Las 4000とかの時代のものだと、 フォーカス調整とか、絞り調整とかする必要があることは知っていますね？ 当方ではLas 2000を使っていましたが、 共用機器だと他のユーザーが設定を変えて、元にもどさなかったり(ミニサイズとミディサイズで違う)して、 初心者は気づかないで困ることは、ありました。

(無題) 削除/引用 No.12357-36 - 2024/06/08 (土) 07:19:30 - nerune >[Re:33] あのさんは書きました : > 撮影装置のメーカーとモデル名は何ですか？ > > > ECLのメーカーと品番は何ですか？蓋はきっちりと閉めて、指定温度で保存していますか？ イメージャーで検出しています。富士フィルムのLAS4000というものを使用しているのですが、かなり古い機械だとは思います。 また、検出試薬は富士フィルムのイムノスターLDというものを使用しています。 （型番：296-69901）

(無題) 削除/引用 No.12357-35 - 2024/06/08 (土) 04:09:17 - たこ あ、私の場合別の用途で使ってたHRP標識抗体があったからわかったんですが、ポジティブコントロールがないとダメか。 まあどっちも問題がなければ光るんでいいんでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.12357-34 - 2024/06/08 (土) 04:06:58 - たこ ECLの試薬が問題なら、混ぜた後にHRP標識２次抗体を1μlでも入れて発光するかみれば一発だと思うので実験を開始する前にそこをやったらいいと思う。 イメージャーにいれて撮影するもよし、暗室で見るもよし。 以前それでHRPのヘタリを確認しました。 蛇足かもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.12357-33 - 2024/06/08 (土) 03:53:49 - あの 撮影装置のメーカーとモデル名は何ですか？ ECLのメーカーと品番は何ですか？蓋はきっちりと閉めて、指定温度で保存していますか？

(無題) 削除/引用 No.12357-32 - 2024/06/08 (土) 03:30:04 - おお で、検出系はX-rayフィルムで焼いているのでしょうか、イメージャーで撮っているのでしょうか。 私はこれまでイメージャーで取っていることを前提に話してましたが。。。 イメージャーでバックが上がることに関しては、膜の部分が黒くなっていくばあい、膜の周り（全体）が黒くなっていく場合があると思います。そういうのもちょっとヒントになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12357-31 - 2024/06/08 (土) 03:01:26 - E 私もECLからフィルムで検出した場合、全くバンドが出ず真っ白な場合がありました。その時は真っ先にECLを疑います。メジャーな会社の一般的に使われる抗体でしたらそれほどハズレはないように思います。ECLは私は新しい古いよりもメーカーを気にします。ミリポア社のものを使っていてこれを変える気はありません。以前バイオ・ラッドの営業がサンプルのECLを置いていって使ってみたら真っ白で、その直後いつもので試したらバッチリとバンドが出たので、今後営業がサンプルをくれても変える気はないです。ベータアクチンすら出ないのはおかしいですね。フィルムでしたら試しにフィルムの反応をオーバーナイトさせて、次の日に現像してみてください。うっすらとバンドが出るかも。

(無題) 削除/引用 No.12357-30 - 2024/06/08 (土) 01:32:55 - おお 試薬に関しては稀にロット不良など起こることがあるので、一応メーカーに問い合わせたほうがいいでしょう（解決しない場合が多いかもしれないけど）。 経験的なことをいうと、新調したECLキットでバンドが全くですへんだなぁとECL買ったメーカーに問い合わせたら、そのロットはずいぶん昔のもので使用期限切れてますと言われたことがあります。どうやら代理店が使用期限を意識してなかったか管理できてなかったようです。

(無題) 削除/引用 No.12357-29 - 2024/06/07 (金) 23:45:35 - おお >[Re:25] signalさんは書きました : > 研究室でWBを行っている人が私しかいないんです。 > > 検出試薬は2ヶ月ほど前に新調したものを使用しています。 短い物は2ヶ月ぐらいで使用期限を過ぎてしまいます。そのキットは同じ頃に他の人も使っていてワークしていましたか？裏技として30％程のH2O2 を1000から2000倍希釈になるように加えると言うのがキットはによっては可能。

(無題) 削除/引用 No.12357-28 - 2024/06/07 (金) 20:50:09 - あの ウエスタンは、複雑なステップなので、一つ一つ確認する必要があります。 たとえば、 分子量マーカーは、カラー付きで、トランスファーはうまく行っていることを自分で確認できていますか？ できれば、ルーティンに実施しているラボに入れてもらって、手技をみたり、手伝ってもらった方が良いです。指導教官から、他のラボにお願いしてもらえると良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.12357-27 - 2024/06/07 (金) 19:18:35 - signal はい。必ずチップは変えるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.12357-26 - 2024/06/07 (金) 19:17:20 - あの 念のため確認ですが、　ECLのA液吸うのに使ったチップをB液吸うのに使ったりしていませんね？

(無題) 削除/引用 No.12357-25 - 2024/06/07 (金) 19:02:05 - signal 研究室でWBを行っている人が私しかいないんです。 検出試薬は2ヶ月ほど前に新調したものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.12357-24 - 2024/06/07 (金) 18:50:53 - bんj 検出試薬(ECL)が劣化してるのかもしれないですね。研究室で同じ試薬を使う他の人はうまくいってるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12357-23 - 2024/06/07 (金) 18:36:47 - signal みなさま アドバイスいただきありがとうございます。 本日、二次抗体、ブロッキング溶液をフレッシュなものにして行ってみたのですが、ベータアクチンのバンドすらはっきり見えず、、 教授とデスカスをして、これか？と思ったのですが、 これまで一次抗体、二次抗体どちらともTBSTのみで希釈していました。（BSA などは入れていません。） これにより、抗体が失活してるのでは？などと提案してもらったのですが、そのような可能性もあり得るのでしょうか。 また、可能でしたら、みなさんが抗体を希釈する溶液を教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.12357-22 - 2024/06/07 (金) 17:01:57 - あの ももさん　おおさん ありがとうございます。 たぶん次の論文ですね 　 　https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003269783710687

(無題) 削除/引用 No.12357-21 - 2024/06/07 (金) 14:10:57 - おお >[Re:20] ももさんは書きました : > ミルクも抗体も使いまわしているとのことですが、アジ化ナトリウム、防腐剤に入れてませんか？ > > HRPはアジ化ナトリウムと反応するので、一緒には使えないことがほとんどです。なので二時抗体を防腐剤込みで使いたいのでしたらチメロサールにするか、 チメロサールって水銀の廃液めんどくさくないですか？廃液処理に結構金かかってSAFETY　OFFICEに嫌がられそうなイメージが。 APにするって言う手もあるかもよ。アジ化ナトリウムってミルクのブロッキング剤でどれくらい持つんでしょうか。 こうたいはんのう、ブロッキングを通して4度でやると言うてもアルカナ。

NaN3は？ 削除/引用 No.12357-20 - 2024/06/07 (金) 13:43:14 - もも ミルクも抗体も使いまわしているとのことですが、アジ化ナトリウム、防腐剤に入れてませんか？ HRPはアジ化ナトリウムと反応するので、一緒には使えないことがほとんどです。なので二時抗体を防腐剤込みで使いたいのでしたらチメロサールにするか、蛍光にした方がいいかも知れません。 なお、PVPはTBS-Tと使うと免疫染色に使えるとHaycockが１９９３年に論文を出しています。私はBSAを使っていますが…ヤギは高すぎるし、ミルクはフィルターしなければならなかったりするので…

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