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(無題) 削除/引用 No.12355-10 - 2024/06/06 (木) 22:14:50 - oi おおさま　返信ありがとうございます。 High Resolution Melting analysisという技術もありましたね。 ちょっといろいろ検討しています。ありがとうございます。 SYBR masterさま　返信ありがとうございます。 別にお墨付きをいただきたいのでは全くなく、詳しい方の意見を伺いたかっただけで・・ まあ定量だろうが定性だろうが、一般的にはリアルタイムは複数反復で行うものであり、そうなっている以上何かしらの根拠はありそうということがわかりました。シングルでやるなら私の方でテストして結果見てみようと思います。 みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12355-9 - 2024/06/06 (木) 21:23:20 - SYBR master >[Re:7] oiさんは書きました : > 核酸のハイブリは思った以上にセンシティブなのですね。予備実験が必要との事ですが、例えばサーモフィッシャーが販売しているTaqManprobe assayなんかはバリデーション済なのですが、いかがでしょうか？(MGBプローブで特異性上げてるようですし) 先にも書きましたが、貴方の判断でsingleで行いたければやれば良いんじゃ無いですか?あなたが、この掲示板でsigleでOKとのお墨付きを得たとしても、その回答をした人は、その結果について何の責任取りませんよ。此所で私が、「それならsingleでのＯＫです」と書いても、私は貴方の研究結果に全く責任を持ちませんので、その結果が「ガセ」だった場合、その結果責任は私では無く貴方にあり、「ガセ」データを出した批難の対象者は貴方だけです。なので、好きにしてください。

(無題) 削除/引用 No.12355-8 - 2024/06/06 (木) 01:45:05 - おお High Resolution Melting analysisっていうのもあって、これならプライマーのSNPs特異性は必要ない。塩基配列の違いによるMelting Tempを見ることでSNPsの塩基を特定できる。たしか塩基の違いによるMelting Tempの差が顕著になるような色素をつ使っていたと思う。ぐぐってみると見つかると思う。 どれくらいうまくいくのかはわからないけど。

(無題) 削除/引用 No.12355-7 - 2024/06/06 (木) 00:32:24 - oi SYBER masterさま　返信ありがとうございます。 核酸のハイブリは思った以上にセンシティブなのですね。予備実験が必要との事ですが、例えばサーモフィッシャーが販売しているTaqManprobe assayなんかはバリデーション済なのですが、いかがでしょうか？(MGBプローブで特異性上げてるようですし) https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/snp-genotyping-taqman-assays.html

(無題) 削除/引用 No.12355-6 - 2024/06/05 (水) 22:41:23 - SYBR master >[Re:5] oiさんは書きました : > 私が言いたいのはSYBR masterもおっしゃるTaqMan-probe系になります。 > 外れ値を引いた場合でも、SNPの0か1(例えばCかT等)を間違えることはないような気がしていまして・・ TaqMan-probe系での検出を常時行っていたわけでは無いのですが、個人的には核酸のhybridizationによる選択って、実は結句シビアな条件になる(Micro-arrayが廃れてた原因です)ので、予備実験をかなり重ねないとそのデータが正しいのかどうかの判断が難しくなると思います。特にSNPだとホモ(+ or -)とヘテロ(+/-)の3状態が存在する場合、1反応だけだとデータ解釈に困ることには成りませんか？まあ、ヘテロの場合duplicateでやってもqPCRの結果だけだと判別付きにくいですけど。 あくまでも個人的な意見ですが、SNPのチェックはPCRが簡便なように思えて(論文も沢山有るけど、上手くいったデータしか出てこないし)データ解釈に難しいこともあるので、お金に多少余裕があるのならば、Target-seqでデータを集めた方が無難だと思っています。 個人的にはqPCRでの反復数を少なくしたい事には、ある程度理解できます（普通に行うPCRに比べたら結構メンタル削られますよね)。ヒトの病気が絡んでいたら、特に今回のSARS-CoV2検出なんて、1 react/ day以上は絶対にやりたくないです。

(無題) 削除/引用 No.12355-5 - 2024/06/05 (水) 20:52:00 - oi SYBR masterさま　返信ありがとうございます。 selective PCRやallele specific PCRの場合は、3'末端の1塩基の違いだけだと疑陽性が頻出するので、そもそもN数を増やそうが意味はないと思っています(タグつけたりもう一つ変異を無理やり入れたりして再現性を上げる技術はあるみたいですが) 私が言いたいのはSYBR masterもおっしゃるTaqMan-probe系になります。 外れ値を引いた場合でも、SNPの0か1(例えばCかT等)を間違えることはないような気がしていまして・・例えば立ち上がりが極端に遅い場合は、判定せずに再反応するとか、抽出からやり直すとかを行えばいいのではないかと・・ おおさま　返信ありがとうございます。 そうですよね、少し1プレート位テストとしてどれくらいぶれるのかを見てみるしかないですよね。

(無題) 削除/引用 No.12355-4 - 2024/06/05 (水) 01:50:46 - おお >[Re:1] oiさんは書きました : > qPCRについて質問があり、どなたか教えてください。 > > qPCRで発現解析などで相対定量を実施する場合、N=2〜4程度に反復数を設定するのは、ピペッティング等による誤差が定量値にブレを生じさせるために必要であると理解できるのですが、 それだけでなく、outlierを除外する目的もあるとおもいます。 どなたかここでqPCR、多分RT-qPCRで９６個やると一つぐらいは変なはずれ値が見られるというようなことをおっしゃってました。それに定性といえど、データーは完全に０と１ではないでしょうし。 一度ポジティブ、ネガティブで１２こずつぐらいやってどれくらいブレるか見てみてもいいかもよ。

(無題) 削除/引用 No.12355-3 - 2024/06/05 (水) 00:52:58 - SYBR master >[Re:1] oiさんは書きました : > qPCRについて質問があり、どなたか教えてください。 SNPタイピングだとTaqMan-probe系も有るかと思いましたが、TaqMan-probeによるSNPの検出でも、最低でもduplicateがデータの信頼性=実験系の正しさ(素人が行っても安定した結果が出る)、のために必要だと思いますけど、singleだとデータの信憑性下がりませんか？下がらないと思うなら、別に止めませんけど。

(無題) 削除/引用 No.12355-2 - 2024/06/05 (水) 00:41:16 - SYBR master >[Re:1] oiさんは書きました : > qPCRについて質問があり、どなたか教えてください。 >リアルタイムのSNP自体繊細な技術でもないような気もするので、反復数は1で十分であると個人的には考えているのですが、どうでしょうか？ SNP自体はメインテーマでは無いですがやっていました(whole seqやcloning&seq系です）が、qPCRでSNPをやったこと無いんですけど、結構面倒なPCRに為りませんか？PCRでSNPをチェックするとなると、PCRのprimerの3'末端1塩基でしか区別できないので(selective-PCRと言います)、ちょっとの実験条件でデータぶれやすいので、素人考えでも実験誤差大きくなると思いますけど、それについてはどう考えていますか? 1回のPCRで誤差が出やすい実験系なら、私個人ならdupliいやtriplicateでもデータに不安が残ると思うんですけど、貴方は違いますかね？

qPCRによるSNPタイピングの反復数について 削除/引用 No.12355-1 - 2024/06/04 (火) 22:53:17 - oi qPCRについて質問があり、どなたか教えてください。 qPCRで発現解析などで相対定量を実施する場合、N=2〜4程度に反復数を設定するのは、ピペッティング等による誤差が定量値にブレを生じさせるために必要であると理解できるのですが、例えばSNPタイピングのような定性分析の場合、反復数を2以上設定する必要はあるのでしょうか？ リアルタイムのSNP自体繊細な技術でもないような気もするので、反復数は1で十分であると個人的には考えているのですが、どうでしょうか？

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