BioTechnicalフォーラム [cDNAからのPCRについて]

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No.12352-12 - 2024/06/06 (木) 00:26:18 - コロン

SYBR masterさん

＞total RNAでcDNA作成して電気泳動で確認するこの「お作法」これまで聞いて事が無いし(30-40年位前ならアイソトープでラベルした物を電気泳動した物は見た気がするけど)、1本鎖と2本鎖が区別できる色素で電気泳動しているならともかく、現在では全く意味が無い気がするんだけど、これ、貴方の指導教官に言われてやっているの？
以前、cDNA合成ができているかどうかの確認はどうすればよいか？と指導教員に確認した際に、泳動流してみたら？といった感じでした。

＞これに関して、トピ主は何も答えていないですよね?かなり重要な情報なんですが。
記載不足ですみません。キットに含まれているランダムプライマーを使用しております。

＞もし、reverse-primerの配置が表記が誤記だったとして
5'-aaaaaaGAATTC-標的配列-3'ならば、
標的配列の長さを、たぶん18-20mers位だと思いますが、FwもRevも24-30 mers位まで長くしてみて下さい。多分それで、特に最近の東洋紡のKOD系とかならPCR走ります(保証はしないけど)。
完全に記載ミスです。すみません。SYBR masterさんの書かれた通り5'-aaaaaaGAATTC-標的配列-3'に設計してあります。
長くする、ですね。やってみます。ありがとうございます。

(無題)

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No.12352-11 - 2024/06/05 (水) 23:27:12 - SYBR master

>[Re:1] コロンさんは書きました :
> 組織からtotal RNAを得てそこからcDNAの合成を行った後、cDNAを鋳型に必要なインサート（約1000bp）を切り出そうとしています。
> cDNA合成後、電気泳動にてスメアを確認し、分注して－20℃で保存しています。

total RNAでcDNA作成して電気泳動で確認するこの「お作法」これまで聞いて事が無いし(30-40年位前ならアイソトープでラベルした物を電気泳動した物は見た気がするけど)、1本鎖と2本鎖が区別できる色素で電気泳動しているならともかく、現在では全く意味が無い気がするんだけど、これ、貴方の指導教官に言われてやっているの？

>[Re:4] G25さんは書きました :
> cDNA合成の手順の概要の情報もほしいところ。プライミングはoligo dTですか、Gene specificですか？

これに関して、トピ主は何も答えていないですよね?かなり重要な情報なんですが。

>[Re:6] コロンさんは書きました :
> フォワードが　ポリA-制限酵素サイト-kozac-インサート配列…　になるように、リバースが　インサート配列-制限酵素サイト-ポリA になるように設計しています。

この表記が正しいとすると、primerの設計間違っていませんか?
仮に制限酵素がEcoRIで、かつポリAが制限酵素の足場のもの(一般的には長くても6 mers)だとして、この表記が正しいなら、
forward-primerが
5'-aaaaaGAATTC-標的配列-3'
reverse-primerは
5'-標的配列-GAATTCaaaaaa-3'
になる表記なので、PCRは「絶対に走らない」配列ですけど、設計大丈夫ですか？この前(4月かな)、うちにB4が発注しようとして僕が止めた配列みたいな気がします。

もし、reverse-primerの配置が表記が誤記だったとして
5'-aaaaaaGAATTC-標的配列-3'ならば、
標的配列の長さを、たぶん18-20mers位だと思いますが、FwもRevも24-30 mers位まで長くしてみて下さい。多分それで、特に最近の東洋紡のKOD系とかならPCR走ります(保証はしないけど)。

(無題)

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No.12352-10 - 2024/06/05 (水) 15:18:14 - コロン

G25さん

＞酵素が駄目になっているという意味じゃなくて、酵素のもともとの性能が高くないってことで。

なるほど…。研究室にはEX TaqとGo Taqがあり、これらを使うようにと指導教員から言われているので何も考えずにそれらを使っていました。
ほかのポリメラーゼも確かに試してみたほうがいいですね。ありがとうございます。

＞これ失敗のもとだと思います。
cDNAプールからのprimaryのPCRでいきなりTailつきプライマーを使うなんて無謀とも言える。
しかもそのtailがかなり長い

そうなんですか…衝撃です。まさかそもそもプライマーがよくない可能性があるのですね…。勉強不足でお恥ずかしい限りです。ありがとうございます。

(無題)

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No.12352-9 - 2024/06/04 (火) 15:27:00 - コロン

おおさん

＞特異性が上がります。外側のプライマーセットでは10回も回せば大抵は十分でその一部を取って内側のプライマーセットで増やすといいかと。違うプライマーセットを使う事で最初のプライマーセットの非特異的な産物の増幅を避ける事ができます。nested PCR で調べてみるといいです。

勉強になります。ありがとうございます。
調べてみます。

＞私は先ずはPCRの酵素を違う製品に変えてみる。
pcrのサイクルはタッチダウンにする(これは大抵デフォルト)。
ベタインを加える(これもデフォルト)
cDNAを特異的プライマーで合成する(ターゲットのcDNAだけを合成する)。
RNaseHでcDNA中のRNAを分解する。
mRNAを精製してからcDNAを合成する。

ありがとうございます。一つずつ試してみます。

(無題)

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No.12352-8 - 2024/06/04 (火) 14:58:45 - G25

>EX Taqであっています。研究室にあるものを使用しており、EX Taq自体はほかのPCRでも使っていますので、酵素がダメになっているという可能性も低いかと考えられます…

酵素が駄目になっているという意味じゃなくて、酵素のもともとの性能が高くないってことで。
増幅力も正確性も高いArchia系の耐熱性ポリメラーゼがぎょうさんあるのんに、
ずいぶんクラシックな酵素をつこうてはりますなあ、と言いたかったのです。

>cDNAからの増幅に使用しているgene speは、フォワードが　ポリA-制限酵素サイト-kozac-インサート配列…　になるように、リバースが　インサート配列-制限酵素サイト-ポリA になるように設計しています。

これ失敗のもとだと思います。
cDNAプールからのprimaryのPCRでいきなりTailつきプライマーを使うなんて無謀とも言える。
しかもそのtailがかなり長い。
cDNAプールから特定の標的を増幅するって、そうでなくても結構、難度が高いので、
まず、オーソドックスなプライマーで増幅するべき。それすらできないようではtailed primerは無理なんだから。
一旦増やして単離したPCR産物、あるいはそれをプラスミドにクローニングしたものに対してなら、
tailed primerによるPCRも難しくない。これは増幅が目的でなくて、tailを付加することに目的を絞ればいいので、少ないサイクル数で良い。

(無題)

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No.12352-7 - 2024/06/04 (火) 13:14:22 - おお

>[Re:1] コロンさんは書きました :
> 組織からtotal RNAを得てそこからcDNAの合成を行った後、cDNAを鋳型に必要なインサート（約1000bp）を切り出そうとしています。
> cDNA合成後、電気泳動にてスメアを確認し、
r RNAが大量にある中、そんなに顕著に泳動パターンんが変わるのだろうか。むしろr RNAが見れないなら元々のRNAが分解などで質が悪くなってそうな気もする。ランダムプライマーならもしかしてだけど。

(無題)

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No.12352-6 - 2024/06/04 (火) 13:14:18 - コロン

G25さん

＞同じ鋳型で他の標的は増えますか？
ほかのプライマーで試してみる、ということですね。
やってみます。ありがとうございます。

＞cDNA合成の手順の概要の情報もほしいところ。プライミングはoligo dTですか、Gene specificですか？
cDNAはHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（thermo fisher）を用いて説明書通りに作成しています。
その後gene speにてインサートの増幅を考えています。
実験の流れとしては、cDNA→インサート増幅→TAクローニング→発現ベクターへののせかえ、と進めていきたいので、cDNAからの増幅に使用しているgene speは、フォワードが　ポリA-制限酵素サイト-kozac-インサート配列…　になるように、リバースが　インサート配列-制限酵素サイト-ポリA になるように設計しています。

＞いまならExTaqより性能の良い酵素あるのに、、、と思ったけど、
ver. 2.0なんてのはひょっとしてPrimeSTARの間違いかしらん？
EX Taqであっています。研究室にあるものを使用しており、EX Taq自体はほかのPCRでも使っていますので、酵素がダメになっているという可能性も低いかと考えられます…
↓EX Taq ver.2.0
https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/RR003A/RR003A_DS.pdf

＞nested PCRは有効な手段で、まず最初にやるべきことですね。
nested PCRというのですね。ありがとうございます。勉強になります。

(無題)

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No.12352-5 - 2024/06/04 (火) 13:07:49 - おお

>[Re:3] コロンさんは書きました :
> あさん
>
> なるほど…。それは思いつきもしなかったです。ありがとうございます。
> ただ一段階でやるのと違いがわかりません。

特異性が上がります。外側のプライマーセットでは10回も回せば大抵は十分でその一部を取って内側のプライマーセットで増やすといいかと。違うプライマーセットを使う事で最初のプライマーセットの非特異的な産物の増幅を避ける事ができます。nested PCR で調べてみるといいです。

私は先ずはPCRの酵素を違う製品に変えてみる。
pcrのサイクルはタッチダウンにする(これは大抵デフォルト)。
ベタインを加える(これもデフォルト)
cDNAを特異的プライマーで合成する(ターゲットのcDNAだけを合成する)。
RNaseHでcDNA中のRNAを分解する。
mRNAを精製してからcDNAを合成する。

(無題)

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No.12352-4 - 2024/06/04 (火) 12:20:27 - G25

RT-PCRは標的の発現量が低く転写産物がレアだったりするとかかりにくく、サンブルによってabundanceや品質も違いますから、できたりできなかったりということはあると思います。

同じ鋳型で他の標的は増えますか？　発現量の多い標的も増えが悪いようだと、
見込み薄いですから、初めからやりなおしということにもなりかねない。

cDNA合成の手順の概要の情報もほしいところ。プライミングはoligo dTですか、Gene specificですか？

>Premix EXTaq(version 2.0)
いまならExTaqより性能の良い酵素あるのに、、、と思ったけど、
ver. 2.0なんてのはひょっとしてPrimeSTARの間違いかしらん？

nested PCRは有効な手段で、まず最初にやるべきことですね。
RT-PCRでcDNAをクローニングするための市販のキットもnested PCRがデフォだったりします。

(無題)

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No.12352-3 - 2024/06/04 (火) 12:00:56 - コロン

あさん

なるほど…。それは思いつきもしなかったです。ありがとうございます。
ただ一段階でやるのと違いがわかりません。
無知で大変お恥ずかしいのですが、内側のプライマーを作って二段階でやるメリットをお教えいただけないでしょうか？

(無題)

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No.12352-2 - 2024/06/04 (火) 11:24:54 - あ

両側のプライマーのほんの少し内側にもう一組プライマーを合成して、その内側のプライマーセットで最初のPCR溶液をテンプレートに２段階目のPCRをかけたらどうですか？

cDNAからのPCRについて

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No.12352-1 - 2024/06/04 (火) 11:13:59 - コロン

組織からtotal RNAを得てそこからcDNAの合成を行った後、cDNAを鋳型に必要なインサート（約1000bp）を切り出そうとしています。
cDNA合成後、電気泳動にてスメアを確認し、分注して－20℃で保存しています。
これをサンプルとしてPCRをかけているのですが、バンドが全く得られません。

条件↓
Premix EXTaq(version 2.0) 12.5uL
primerF(10uM) 0.5uL
primerR(10uM) 0.5uL
cDNA 2uL
N-free water up to 25uL

98℃ 30s(初期変性)
98℃ 10s
55℃ 30s
72℃ 1min
30サイクル

以前一度だけうまくいったことがあるので、アニーリング温度等サイクル条件は変える必要がないと思うのですが…。鋳型としているcDNAはうまくいった時と同じものではなく、新たに取り出したものです。
cDNAの濃度が濃すぎることを予想し、×5, 10, 50, 100, 500, 1000でも試してみましたが、やはりだめでした。

なにかアドバイスを頂けないでしょうか？

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