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(無題) 削除/引用 No.12352-33 - 2024/06/08 (土) 19:26:38 - コロン みなさま 大変貴重な意見交換をしていただきありがとうございました。 分子生物学を始めたばかりの素人でして、自分の勉強不足を痛感いたしました。 みなさまからいただいたご意見を一つずつ確かめていこうと思います。 またよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12352-32 - 2024/06/07 (金) 01:35:55 - おお >たまに3'-UTRが超長いものが有ったりしたとき(たしかmouseのPeriodだっけ)は、specific-primerでRTしました。 oligodTと言いながらそこが気になっていて、一応言及しとかなくっちゃと一時的に思ってましたがわすれてた。。。 >coding-seqをPCRで得るときに、Random-primerでRTを行うのって、意識の中に無いですね。 確かに私もランダムプライマーを使わないですね。実際やる段になったらそこは絶対に意識するところではあります。

(無題) 削除/引用 No.12352-31 - 2024/06/06 (木) 23:01:49 - SYBR master >[Re:25] codon+optimizationさんは書きました : > ランダムプライマーでcDNAライブラリーを作製したことはありますか？ えーっと、たぶんG25さんって、cDNAライブラリー作るのが流行った(w)時期に博士課程かポスドク or 今の助教(当時は助手って言って)もしくは留学帰りの助教授(今だと准教授)の人だよ?(だって確実に、おいらより年上だもの、一時期私が「爺」と茶化したくらい)。ちなみに僕が作ったcDNAライブラリーでは、標的細胞は真核なのでランダムプライマーで作成することは、一度も無かったです。当時原核の連中からoligo-d(T)でcDNAライブラリーが作成できることについて、羨ましいと言われたことはあります（この意味解ります?)。 >[Re:27] おおさんは書きました : > ま、ランダムプライマーで増えてない現状があるのだから、質問の件ではオリゴdT でやるべき案件ですね。ちょっと反射的に反論してしまいました。 RNAウイルスを扱っていたときに、mRNAなのかgRNAなのかを区別する為に、oligo-d(T)でRTしたデータを出せとreviwerから言われたことありますね。個人的にはcodingをfullで取るためなら、RTは3'-RACE出来るOligo-d(T)が第一選択です。大体これでOKなのですが、たまに3'-UTRが超長いものが有ったりしたとき(たしかmouseのPeriodだっけ)は、specific-primerでRTしました。coding-seqをPCRで得るときに、Random-primerでRTを行うのって、意識の中に無いですね。RT-qPCRですら、個人的にはRandom-primerで逆転写はデータ的に大丈夫？って思っています。

(無題) 削除/引用 No.12352-30 - 2024/06/06 (木) 22:21:36 - SYBR master >[Re:29] joyさんは書きました : > 逆転写酵素って、鎖置換活性を持っていることが多いので、伸長先にランダムプライマーの5'末端にぶつかっても、そのプライマーを剥がしながら合成が進んだりはしないのでしょうか？(そう思い込んでいました・・) 1.確かに今販売されている逆転写酵素(reverse transcriptase; RTase)は鎖置換活性(strand displacement activity; SDA)を持っていますが、初期のRTaseはその活性が非常に弱く、「ほぼ無い」と見なすことが出来ました。実際、Random primerで逆転写したcDNAは、説明文でG25さんが言っているように分断化されたcDNAの絵が描かれていますし、確かアイソトープラベル(32P)したcDNAの電気泳動もそれを示唆する結果になっていたと記憶しています。いまは作られなくなりましたが、cDNA libraryの作成はこのアイソトープでのラベルは当時必須とされていました。 2. RNaseH活性を削ったRTaseが販売され始めた頃(1990年代)から、少しSDAの活性が見られるようになりましたが(今データ見たらそうかも?って言うレベル)、未だ認識出来るレベルではなかったと思う。また、この頃当たり(1995年くらい)からアイソトープでラベルしてかつ電気泳動で確認、の作業がRT-PCRの場合では省かれ始めたと記憶しています。 3.日本を含め各メーカーからRTaseの変異体を販売するようになって(特許が切れた?)、たしかNEBのRTase（製品名忘れた)が最初に、「SDA活性有ります」って売り出したけど、そのSDA活性については「売り」にはしてなかったと記憶しています。 4. TakaraのPrimeScript(IIだったかも)で結構強めのSDA活性が有ることが分かり、それを「売り」にしようとしていたのが、2013-2014年頃だったと思います。 基本的に今販売されているRTaseはほぼSDA活性持っていると思いますが、公開されているデータが少なすぎて、SDA活性を売りにしているBstやphi29 DNA polymeraseに比べると激弱と考えて良さそう(上記のpolがほぼ無限にSDAを行えるけど、RTaseは同じかどうかは知らない)ですし、ほぼ無いと考えて使って、SDAが見られたら「ラッキー」くらいの考え方が良いと思っています。 以上の書き込みは、あくまで「おじさん」が時間経過とともに見てきた物を予想して判断した結果で、正しい歴史では無い可能性もあるので、話半分で記憶しておいてください。

(無題) 削除/引用 No.12352-29 - 2024/06/06 (木) 18:19:47 - joy すみません、横から失礼します。 ＞ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります ＞プライマーが濃いと伸長した先に結合した別のプライマーでストップしますが、 逆転写酵素って、鎖置換活性を持っていることが多いので、伸長先にランダムプライマーの5'末端にぶつかっても、そのプライマーを剥がしながら合成が進んだりはしないのでしょうか？(そう思い込んでいました・・) それとも、この活性が濃度に依存するということでしょうか？ (私の単純な疑問ですみません)

(無題) 削除/引用 No.12352-28 - 2024/06/06 (木) 17:17:23 - おお 数キロ伸ばせると言うのもちょっと言い過ぎかも知れません数キロ伸ばせる事もあるぐらいじゃないでしょうか。発現量が低ければ、思ったところから思った長さまで伸びたcDNAは少なくなります。またプライミングしにくい場所もあるかもしれませんし。

(無題) 削除/引用 No.12352-27 - 2024/06/06 (木) 17:06:02 - おお ま、ランダムプライマーで増えてない現状があるのだから、質問の件ではオリゴdT でやるべき案件ですね。ちょっと反射的に反論してしまいました。

(無題) 削除/引用 No.12352-26 - 2024/06/06 (木) 16:32:02 - G25 >ランダムプライマーでcDNAライブラリーを作製したことはありますか？ そんなこと言われるまでもないんだけど。 わかったうえで発言しています。 >私の表現が悪かったかもしれませんが、別に必ず200-300 ntになるといいたかったわけでなく、 そのへんは理解していただけると思います。 私の意図は説明済みですが、ご理解いただけないようで残念です。

(無題) 削除/引用 No.12352-25 - 2024/06/06 (木) 16:21:43 - codon+optimization ランダムプライマーでcDNAライブラリーを作製したことはありますか？ 「プライマー濃度によりますが」数kbのインサートなどざらにありますよ。 原理的に可能です。 もちろん、本件で質問者にランダムプライマーを勧めるものではありません。

(無題) 削除/引用 No.12352-24 - 2024/06/06 (木) 16:17:49 - G25 標的が1000 bpくらい短ければランダムでも問題ない、ということもないです。 1000 bpのなかのどの部分にランダムプライマーがつくかはそれこそランダムです。 たまたま1000 bpの3'末端付近に一個ついた鋳型だけが有効なだけで、確率的にそうならない鋳型も多いわけで、結果的に有効な鋳型のコピー数を減らすことになりかねません。 >プライマー濃度により変わるのであるから、「ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。」典型的ではありません。 私の表現が悪かったかもしれませんが、別に必ず200-300 ntになるといいたかったわけでなく、 そのへんは理解していただけると思います。 本題と関係ない揚げ足取りと解します。 再度、いいますが、 質問者が直面している問題に「ランダムプライマーでもいけないことないです」と言ってもしかたがない。使用しているHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitも完全にRT-PCR向けだしね。

(無題) 削除/引用 No.12352-23 - 2024/06/06 (木) 16:03:54 - codon+optimization >ランダムプライマーじゃ原理的に無理です。 原理的に可能です。

(無題) 削除/引用 No.12352-22 - 2024/06/06 (木) 15:56:27 - codon+optimization 全長を1発で取得するのにランダムプライマーが向いてないのはそのとおりです。ですが、今回は1000bp程度がターゲットなので全長取得の話は除外して話を進めます。 プライマー濃度により変わるのであるから、「ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。」典型的ではありません。 200-300ntになるのは高濃度のランダムプライマーを使えばという前提においてです。 たとえばqPCRで100bp程度のアンプリコンの場合は、逆転写効率を高めるために高濃度のランダムプライマーを使いますから、200-300ntというのは正しいかもしれません。しかし、それを一般化しては駄目だと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.12352-21 - 2024/06/06 (木) 15:13:21 - G25 >[Re:18] codon+optimizationさんは書きました : > >ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。 > > これは一概には言えません。 > プライマー濃度に依存します。プライマーが濃いと伸長した先に結合した別のプライマーでストップしますが、薄ければ数kbでも伸びます。 私が書いた本の文は、 >プライマー濃度など条件にもよるけど、ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。 「プライマー濃度など条件にもよるけど」ってかいてるじゃない。 引用から削っているのには意図を感じる。 こういうのを「切り取り」というんだな。

(無題) 削除/引用 No.12352-20 - 2024/06/06 (木) 15:08:05 - G25 >プライマー濃度に依存します。 >実際、10kbとかの長い遺伝子の5'側をクローニングする際には、oligo dTからの伸長では効率が悪くなるので、意図的にランダムプライマーを選びます。 それはよーく存じていますけど、 カバーしきれない5'側を補うためにやることで、あとからつなぎ合わせて全長をとろうというのであって、それだけで全長を一本取りしようというのではないですね。よくあるのはoligo-dTプライミングでできるだけ長いのをとって、足りない分をランダムプライミングでとるという戦術。 >薄ければ数kbでも伸びます。 というのは盛りすぎじゃなかろか。 RTaseはprocessivityが高くないし、鋳型の二次構造などで止まりやすい。 だからこそ同時多発的に短い距離でcDNAを合成してカバレージを上げるという ランダムプライマーのメリットがあるわけです。 ランダムプライマーの濃度を薄くすると平均鎖長は伸びるだろうけど、収量やカバレージが下がってメリットも薄まりかねない。 いずれにせよ、質問者が直面している問題に「ランダムプライマーでもいけないことないです」と言ってもしかたがない。使用しているHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitも完全にRT-PCR向けだしね。

(無題) 削除/引用 No.12352-19 - 2024/06/06 (木) 14:45:18 - おお >[Re:18] codon+optimizationさんは書きました : > >ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。 > > これは一概には言えません。 > プライマー濃度に依存します。プライマーが濃いと伸長した先に結合した別のプライマーでストップしますが、薄ければ数kbでも伸びます。 それは、その事を意識してデザインしているかによるし、そのための対策をしているようには思えないのだが、、、個人的には薄めでやると言うのはありましたけど。

(無題) 削除/引用 No.12352-18 - 2024/06/06 (木) 14:12:54 - codon+optimization >ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。 これは一概には言えません。 プライマー濃度に依存します。プライマーが濃いと伸長した先に結合した別のプライマーでストップしますが、薄ければ数kbでも伸びます。 実際、10kbとかの長い遺伝子の5'側をクローニングする際には、oligo dTからの伸長では効率が悪くなるので、意図的にランダムプライマーを選びます。

(無題) 削除/引用 No.12352-17 - 2024/06/06 (木) 13:11:26 - G25 長いcDNAを取得するのに向かないrandom primerでRTしているところ いきなりtailed primerでPCRをかけようとしているところ 安価だけど性能が最小限ラインのExGTaqやGO Taq を使っているところ どれもこのような実験に困難をもたらすもので、 どれか一つだけでも不成功をまねくだけのインパクトがあると思います。

(無題) 削除/引用 No.12352-16 - 2024/06/06 (木) 09:37:38 - おお はい、原理的にだめなのはわかるのですが、１kbぐらいなら増えます（確かに必ずそうと言うのば無謀だけど）。おそらくオーバーラップしたところからの伸長があるためと思われます。

(無題) 削除/引用 No.12352-15 - 2024/06/06 (木) 09:22:32 - G25 >> 記載不足ですみません。キットに含まれているランダムプライマーを使用しております。 >オリゴdTのほうがいいです。 のほうがいいどころか、ランダムプライマーじゃ原理的に無理です。 プライマー濃度など条件にもよるけど、ランダムプライマーで合成したcDNAは平均鎖長200-300 ntくらいの断片の集合になります。ランダムプライマーは逆転写効率やcDNAのcoverageは優れているので、短い標的配列でやる定量PCRには適していますけど、全長近いcDNAのクローニングなんかには使えません。 >以前一度だけうまくいったことがあるので、 これが奇跡的

(無題) 削除/引用 No.12352-13 - 2024/06/06 (木) 00:48:50 - おお >[Re:12] コロンさんは書きました : > > ＞これに関して、トピ主は何も答えていないですよね?かなり重要な情報なんですが。 > 記載不足ですみません。キットに含まれているランダムプライマーを使用しております。 > オリゴdTのほうがいいです。ランダムプライマーだったらポリAより上流のところから逆転写が始まるものも多いですから全長のcDNAがかなり少なくなっていはずです。あるいは前に書いたようにPCRで使おうとするリバースプライマーを使うか。 >cDNA合成ができているかどうかの確認はどうすればよいか？と指導教員に確認した際に、泳動流してみたら？といった感じでした。 指摘されているように普通はやりません。で、それでどのように判断するか基準がありますか？例えばプライマーなしでRTして違いが出てますか？顕著な違いで判断できるというなら別にそれでもいいです。2本鎖でシグナルの出るような色素ならわからなくもないですが、実際どうなんでしょうかねえ。エチブロだって２本鎖と１本鎖でシグナルの強度はかなり違うはず。 と、こんな感じでよろしいでしょうか、SYBR masterさん。なんか反射的にコメントつけてしまった。

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