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(無題) 削除/引用 No.12351-11 - 2024/06/10 (月) 22:29:37 - G25 私は組換えを防げば解決できるという考えに非常に懐疑的です。 インタクトでは毒性で生えてこないから、組換えて遺伝子が潰れたものだけが生えてくる。 組換えを阻止したら遺伝子が潰れにくくなって一個も生えてこないか、それでも変異したレアなクローンしか生えてこないという結果になると予想します。 外来遺伝子の発現の目的は？ 発現タンパク質を取得するプレパラティブな目的なのか、形質転換体でin vivo の生理機能を見るのか？ 発現制御は誘導性のプロモータなのか内在性のプロモータなのか。 その辺はいかがでしょうか in vivoであればプレパラティブ実験のように強いプロモータは必要ないので、発現量の低いプロモーターにするとかあるかも知れないけど、

(無題) 削除/引用 No.12351-10 - 2024/06/10 (月) 12:29:18 - おお 大腸菌において導入したプラスミドから毒性があるペプチドの発現が疑われる場合の工夫は色々あれど、そのペプチドの発現を抑えることです。 大腸菌で使われている手法が対象の菌でうまくいくかどうかはやってみないとわからないという事もあるでしょう。それならコードする蛋白のコドンをレアコドンに変更して蛋白合成の効率を落としてみるというのはもしかしたら通用するかもしれません。 それとすでに言及されているかわかりませんが、選択につかう抗生物質の濃度も大腸菌のプラスミドのコピー数に影響します。ですからお使いの抗生物質の濃度も下げていいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12351-9 - 2024/06/09 (日) 07:39:46 - おお >欠失箇所の両端には (短いもので8塩基ほどの) 相同配列が見つかるため相同組み換えが生じていると考え、 菌体のほうじゃなくて、その相同性のある部分、蛋白をコーディングしているなら同じアミノ酸の違うコドンに入れ替えていって相同性を潰す（弱く）してみたらどうかしら。

(無題) 削除/引用 No.12351-8 - 2024/06/05 (水) 17:49:22 - ECAB > あくまでも「大腸菌では」ですよね。 はい。大腸菌では大丈夫だから自分の使っている菌でも大丈夫だ、という意図ではございませんでした。あくまでも先行研究の時点でわかっていることに言及したまでです。 > 同じ遺伝子なのに大腸菌では組換えて不安定ということはないわけですか？ 文意が取れず申し訳ございません。 > 先行研究に組換え能欠損の特殊な株を使っているなど言及はありましたか。 ありませんでした。BL21(DE3)やRostta等です > 組換タンパク質/標的組換え配列（FLP/FRTやCre-loxPみたいな）でもなければ、 > 全プラスミドが一斉に組換えるなんてことないと思うんです。反復配列があるというだけなら、散発的に組換えが起こって、組換えたやつも組換えてないやつも混在しているとか、組換えていないやつを単離してもpropagateしているうちに組換えたやつが出てくるとか、そういう感じじゃないでしょうか。 > しかるに、取れたプラスミドが全部組換えているとなると、intactは配列に対して選択圧が働いている可能性がかなりあります。 > 本当かどうかは確かめないと言えませんが、あなたの細菌には有害だけど、大腸菌には害がなかったから、intactなのが取れたたし大量発現もできたということで一応、辻褄は合います。 選択圧が生じている可能性は高いです。そのような状況からインサートをintactに保持したプラスミド保持クローンが取れる確率を上げるために施せる遺伝子改変 (その他の方法でも) があればと意図したトピックでした。 > ちなみに、その外来遺伝子の由来生物はなんですか。分類群など差し支えない範囲で。 合成的に構築された生合成経路を触媒する酵素遺伝子で、大腸菌、クロストリジウム、アシネトバクターなどが由来です > そもそも大腸菌でも増殖可能なプラスミドベクターなんですか？ はい。ベクター構築は大腸菌で行っております。p15A及びpUC oriのプラスミドをバックボーンに作製しており、どちらでもインサートの欠落が生じてしまう状況です。

(無題) 削除/引用 No.12351-7 - 2024/06/05 (水) 17:05:25 - ECAB >[Re:4] おおさんは書きました : > restriction-modification system の違いで壊れやすくなってるとか？ > recBCD とか？ おお様 ご回答いただきどうもありがとうございます。 recBCD系を破壊しているコンピテントセルもあることを先ほど調べて初めて知りました。 recAよりは直接的に相同組み換えを抑制してくれそうな感じはします。

(無題) 削除/引用 No.12351-6 - 2024/06/05 (水) 13:07:43 - G25 >ご回答いただきどうもありがとうございます。 今回導入したい遺伝子を大腸菌で高レベルに (T7プロモーター制御下) 発現させている先行研究があるのですが、生育などに問題は生じていないようです。 あくまでも「大腸菌では」ですよね。 同じ遺伝子なのに大腸菌では組換えて不安定ということはないわけですか？ 先行研究に組換え能欠損の特殊な株を使っているなど言及はありましたか。 組換タンパク質/標的組換え配列（FLP/FRTやCre-loxPみたいな）でもなければ、 全プラスミドが一斉に組換えるなんてことないと思うんです。反復配列があるというだけなら、散発的に組換えが起こって、組換えたやつも組換えてないやつも混在しているとか、組換えていないやつを単離してもpropagateしているうちに組換えたやつが出てくるとか、そういう感じじゃないでしょうか。 しかるに、取れたプラスミドが全部組換えているとなると、intactは配列に対して選択圧が働いている可能性がかなりあります。 本当かどうかは確かめないと言えませんが、あなたの細菌には有害だけど、大腸菌には害がなかったから、intactなのが取れたたし大量発現もできたということで一応、辻褄は合います。 ちなみに、その外来遺伝子の由来生物はなんですか。分類群など差し支えない範囲で。 >大腸菌でのコピー数は他の細菌に導入した際の参考になりますでしょうか？ そもそも大腸菌でも増殖可能なプラスミドベクターなんですか？

(無題) 削除/引用 No.12351-5 - 2024/06/05 (水) 10:56:00 - ECAB >[Re:2] G25さんは書きました : > その外来遺伝子が宿主にとって有害である可能性がある > 大腸菌ならコピー数の少ないレプリコンにするとか、発現誘導性のベクターで非誘導時のリークが厳密に抑えられているものにするとか、温度を下げてみるとか、しますけど。 G25様 ご回答いただきどうもありがとうございます。 今回導入したい遺伝子を大腸菌で高レベルに (T7プロモーター制御下) 発現させている先行研究があるのですが、生育などに問題は生じていないようです。 大腸菌を使用するのであればご提案いただいた方法をとるのが一般的かと思います。 大腸菌でのコピー数は他の細菌に導入した際の参考になりますでしょうか？ 異種細菌間での各レプリコンのコピー数を比較した論文などあれば読んでみたいところです。

(無題) 削除/引用 No.12351-4 - 2024/06/03 (月) 22:37:39 - おお restriction-modification system の違いで壊れやすくなってるとか？

(無題) 削除/引用 No.12351-3 - 2024/06/03 (月) 17:03:29 - おお recBCD とか？

(無題) 削除/引用 No.12351-2 - 2024/06/03 (月) 16:34:12 - G25 その外来遺伝子が宿主にとって有害である可能性はないですか。 組換えを抑制できたとしても、intactなプラスミドではもともと生えないんじゃないかという危惧があります。 だとしたらどーする？ 大腸菌ならコピー数の少ないレプリコンにするとか、発現誘導性のベクターで非誘導時のリークが厳密に抑えられているものにするとか、温度を下げてみるとか、しますけど。

recA破壊以外のプラスミドのインサート欠落を防ぐ方法 削除/引用 No.12351-1 - 2024/06/03 (月) 15:03:26 - ECAB ある細菌 (大腸菌ではありません) にプラスミドを保持させ、外来遺伝子を発現させる実験を行っているのですが、インサート領域が欠失したプラスミドを保持する形質転換体ばかり得られてしまうトラブルに見舞われています。 欠失箇所の両端には (短いもので8塩基ほどの) 相同配列が見つかるため相同組み換えが生じていると考え、recA破壊株を作製したのですが、それでもインサートの欠失が防げません。 このようなトラブル時に有効な対処法をご存知の方がいらっしゃいましたら、是非ご教示いただければと思います。

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