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(無題) 削除/引用 No.12350-13 - 2024/06/03 (月) 11:42:17 - おお でその酵素なんですが、Hotスタートように調製されたものでなさそうなのですが、手動HotStartができるのをご存知ですか？ サーマルサイクラーの初期温度を９４度とかに設定しておいて、そこにチューブをセットしてサイクルを回すというやり方です。もしすでにそうしてたら役に立たなくてすいません。

(無題) 削除/引用 No.12350-12 - 2024/06/03 (月) 11:15:25 - おお どうでもいいけど最近は回答、コメントの欄に広告が入ったりするようになったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12350-11 - 2024/06/03 (月) 11:05:25 - わたる TSさん　ご助言ありがとうございます。 ラボ内にあるほかのPCR酵素も使ってみようと思います。 まだ実験に慣れないうちだったのでプライマーの扱いになにか不手際があったのかもしれません...丁重に扱わないと駄目ですね反省してます...

(無題) 削除/引用 No.12350-10 - 2024/06/03 (月) 11:02:44 - わたる おおさん　たくさんのご助言ありがとうございます。 使用している酵素は他の人も使用しており、正しく増幅できているようです（皆、種は違うものの魚類を対象にしております。 ） DNAは昔うまくいったものを様々なアニーリング温度で使用したのですが、ダイマーしか見られませんでした。最近に実験では直近で抽出しなおしたDNAを使用しております。 タッチダウンPCRや伸長時間、ベタイン等は試したことがありませんでした。やってみたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12350-9 - 2024/06/03 (月) 10:46:32 - TS 状況は違いますが、Genomic DNAを使うGenotypingでも酵素によって、かかりにくいとかがあります。色々なところで、PCR酵素やキットの試供品が放出されているので、いくつかもらってみたらどうですか。お金もあまりかからないので、指導教員もダメとは言わなそうです。 これまでの経緯や再現性もあるでしょうし、最初にプライマーなどの試薬類を一新してみたらどうかと思いましたが、何となく指導教員の先生は対応してくれなそうですよね。 プライマーがダメになりにくい、というのは正しいと思いますが、学生さんが教員の想定している取り扱いを厳守しているとは限らないですね（わたるさんのことを非難しているわけではなく）。色々と想定外のことが起きるので。。。

(無題) 削除/引用 No.12350-8 - 2024/06/03 (月) 10:26:58 - おお 結構至適条件がシビアなんでしょうかねぇ。その酵素はラボの他の人は使ってますか？それでワークしているのならまあ多分大丈夫かな。分注して配られているならワークしているやつを一回使わせてもらってもいいかも。 DNAは昔うまくいったサンプルですか？それとも新たに精製したサンプルですか？新たに精製したものなら昔やったサンプルも同時にやってみるといいでしょう。 魚の鰭切片は扱ったことがないですが、なにかPCRを阻害するようなものが含まれたりしてませんか？この辺はよくわからないのでラボでなにか知っていることがないか、文献でそういうことが示されてないか確認してみるといいかもしれません。 15ngで大丈夫だとおもいますが、もう少し増やしてみてもいいかもしれません（５０ngぐらいまでかなぁ）。精製でRNAが交じる可能性がある方法だと結構多めに見積もられているかもしれませんから、そのへんも方法論を確認してみればいいかと。 結構至適条件がシビアといいましたが、ゲノムの場合配列の複雑性が高いのでプライマーによってはかかりにくかったりします。で私はとりあえずはタッチダウンPCRで特異性を高めるようにして、条件を探すのは避けてます。詳しくはタッチダウンPCRを調べてください。 あと簡単なやりくりとしてはバンドが出ないか短いもがドミナントのとき伸長反応時間を長めに取ります。期待したものより長いノンスペが出るときは短くします。また大抵のPCRで私はベタインをとりあえずれています。１Mぐらいいれるプロトコールが多いですが、０．５M位入れてます。というのもマスターミックスで売られているものは色々すでに入ってそうだから少なめにしてます。

(無題) 削除/引用 No.12350-7 - 2024/06/03 (月) 09:57:11 - わたる TSさん　ありがとうございます 仰るようにGenomic DNAです。魚の鰭切片からDNAを抽出し使用しております。 サーマルサイクラーを使用しPCRをかけています（KAPA2G Fast PCR Kitを使用）

(無題) 削除/引用 No.12350-6 - 2024/06/03 (月) 09:54:28 - わたる わかばさん　ご質問ありがとうございます。 初歩的過ぎる質問にも答えられずお恥ずかしいのですが... 現在自分が使っているプライマーは一組なく、ほかのプライマーは試したことがありませんでした。ユニバーサルプライマー？などで増幅を確認すればよいのでしょか（勉強不足で申し訳ございません）

(無題) 削除/引用 No.12350-5 - 2024/06/03 (月) 09:42:36 - TS テンプレートはGenomic DNAということでしょうか。RT-PCRかなと最初思ったものですから。

(無題) 削除/引用 No.12350-4 - 2024/06/03 (月) 09:37:27 - わかば 初歩的すぎる質問だとは思いますが、他のプライマーではちゃんとバンドが出るんですよね？

(無題) 削除/引用 No.12350-3 - 2024/06/03 (月) 09:29:41 - わたる アドバイスありがとうございます。 テンプレートDNAのほうは分光光度計を用いて吸光度をそくていし、純度の高いものを使用しています。（新しく抽出しなおしたりしています）またテンプレート濃度は 15ng/ulになるよう調整し、PCRにおいては1ul使用しています。 なにか疑うべきところ、変える必要があればご教授いただけると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.12350-2 - 2024/06/03 (月) 09:01:25 - noname プライマーより、テンプレートの方を疑ったほうがよろしいかと思います。

PCR実験について（失敗続きで困っています） 削除/引用 No.12350-1 - 2024/06/03 (月) 08:51:06 - わたる 私は現在、分子生態学系のラボに所属する学部4年生です。 ここ最近PCR実験で目的のバンド（500bp前後）が全く出ず、100bpに満たないバンドのみが検出されます。（おそらくプライマーダイマーだと考えています） 特に頭を悩ましているのが、2月頃に行ったPCR実験では、失敗続きの現在と全く同じ条件（プライマー、酵素、テンプレート）で行っていたのに、目的のバンドがでていたことです。少し期間があいて、５月頃から実験を再開してからは目的バンドが得られずダイマーしか検出されません。 私のなんらかの不手際でプライマーが失活してしまったと考え、指導教員に新しいものの購入をお願いしたのですが 「実験操作のもんだいじゃないのか」、「プライマーがすぐダメになるとは考えられない」と言われ足踏みしています。 実験操作は先輩となんども一緒に確認しながら進めたり、またPCRプロトコルも様々な温度条件（アニーリング温度を大きく下げたり上げたり）を試しました。しかし何をしてもダイマーのみが検出されも目的のバンドが出ません。ネガコンにもいつも100bpにみたいないバンドが映ります。 なかなか指導教員に相手にされずとても困っています。みなさまのご意見お聞かせいただけたら幸いです。

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