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(無題) 削除/引用 No.12350-35 - 2024/06/05 (水) 00:14:48 - SYBR master >[Re:32] AAさんは書きました : > 10年ちょっと前にBioradのS1000だったかT100だったかを買ったときにメーカーの人に「結露するから4度は避けてほしい」と言われました。 うちもBioradのT100(うちのボスが「安かったのよー」、2台で導入した)を納品されたとき、同じ事言われましたね。結露+NaClとも言っていたので、海に近い研究所(OISTとかJAMSTECとか)でなんかあったんでは無いでしょうか。海近いと空気中の水蒸気に塩分が含まれること多いと聞いてますので(半導体工場が長らく海のそばに作られなかった理由だと、20年前くらいに聞きました)。

(無題) 削除/引用 No.12350-34 - 2024/06/04 (火) 19:10:53 - G25 PE9700とかiCyclerとか昔の機械は、ブロック上にスリーブ（枠）をおいたり、スカート付きのPCRプレートをつかったりしないと、リッドとブロックの隙間ががらあきで、外気に触れまくりだった。 スリーブをつけわすれると、ブロックからチューブが首をだしたあたりで反応液が結露したり、4℃キープ中にブロックが結露しまくった。スリーブがあっても密閉は甘かったんじゃないかしら。 最近のサーマルサイクラーはhot lidがブロック上をすっぽり密閉して外気が入りにくいようになっていて結露自体起こりにくくなっている、、、ような気がする。 私も反応後の低温放置はしない主義（最後のステップが終了したらそのままプログラムr停止）なので、実際のところはわからんけれど。 ４℃で放置するなというのは、ペルティエ方式のサーマルサイクラーが普及し始めたころに言われ始めたように記憶します。それ以前の、ヒーターで加熱、コンプレッサーで冷却していたころのマシンではうるさいこと言われなかった気がする。やっぱり当時のペルティエ特有のウィークポイントだったんじゃないかないかと思います。 どっちにしろ昨今のエコロジー？　SDGs？的な配慮からも、いらぬエネルギーを使わないような実験スケジュールを組みたいもの。

(無題) 削除/引用 No.12350-32 - 2024/06/04 (火) 17:24:44 - AA 10年ちょっと前にBioradのS1000だったかT100だったかを買ったときにメーカーの人に「結露するから4度は避けてほしい」と言われました。欧米の設計者はアジア圏の高湿度な地域の事は考えられていないので何でもオリジナル通りにすると壊れるんだとかなんとか言われた記憶があります。じゃあどうするの？と聞いたら10度ぐらいで・・と言われたので以後はそうしています。(10度でも結露するのでは？とは思いましたが) さて主題のPCRですが、PCRの構成要素を考えると問題が生じるのは ・鋳型 ・酵素 ・プライマー ・バッファー/水 ・サイクルプログラム ・機械 あたりになるでしょうか。 この内、酵素/機械に根本的な問題が生じた場合はすべてのPCRが駄目になるので同じ酵素/機械を使って別のPCRが現状動いているなら除外できそうです。(ペルチェが部分的に駄目になるケースではすべてのRUNが駄目になるわけではないですが、同じような感触を持った人が出るはずと思います) プライマーに問題がある場合は、そのプライマーを使うPCRだけが影響を受けるので他の人がうまく行っていて自分だけうまく行かない場合はプライマーが分解しているケースが多い気がします。特に4度保存のプライマーは意外とだめになります。(部屋の湿度にもよっては頻繁にデフロモードに入っていたなどありました) プライマーは買い直す前にストック濃度のものを再希釈して試すのが一般的かと思いますがそちらは試されたのでしょうか？ サイクルに問題がある場合は指摘のあるタッチダウンをはじめ、色々と最適化を行う必要があると思います。ただ、過去にうまくいっていたPCRが急に条件不適になるとはあまり思えないです。ルーティンで行っている遺伝子型判定PCRがうまく行かないという学生の問題はたいていプログラム以外のところにあります。 もちろん、過去にうまくいっていたと思っていたバンドがそれっぽい非特異だったという可能性もあるので完全に除外はできません。 鋳型に問題があるケースはポジコンがあるなら切り分けられそうですがポジコンになるサンプルがないとちょっと厄介です。とりあえず他の方のうまく行っているPCRに質問者さんのサンプルを混ぜてもらってそのPCRがかかるかどうかで判断でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12350-31 - 2024/06/04 (火) 16:14:25 - BioRad 古い、と言ってもiCyclerよりは新しいBioRadのサーマルサイクラーには「注意　本製品はブロックが乾燥した状態でご使用下さい。結露防止のため、長時間の4°Cホールドでの使用はお控え下さい。推奨ホールド温度：15°C~20°C」と書かれたシールが本体に貼られています。 確かに12°Cで1時間以上ホールドするとかなり結露します。バリバリ現役ですが、骨董品なのかなぁ。。 批判されようとも馬鹿にされようとも私は長時間の4°Cホールドはしません。

(無題) 削除/引用 No.12350-30 - 2024/06/04 (火) 15:46:01 - G25 昔、といってもPE9700とかiCyclerが現役だったころだから、たかだか20年前くらいまで、 ペルティエ素子の性能というか、ペルティエ素子を構成する半導体の純度が良くなかったので、 負荷が蓄積するとすぐに劣化して加熱も冷却もしなくなったものです。 ペルティエ素子自体、当たり外れが大きく、個体差がありましたが、 だいたいどんなメーカーのどんな機種も2~3年ない5年も使うとそうなってしまって、ペルティエ交換で結構な修理費がかかりました。 ４℃放置を禁じる（というか無駄に長時間働かせない）というのはそのころの名残。

(無題) 削除/引用 No.12350-29 - 2024/06/04 (火) 14:53:32 - 准教授 　4℃　 ∞ 私も「ペルチェ素子が劣化して機械がだめになる」と習いましたし、ここのサイトでも大昔これっぽいことをサジェストしてくださっている人がいました。ただ、正しいかどうかわからない経験論を若者に押し付けるのは現代ではコンプラに抵触すると思い、某大手メーカーに問い合わせました。結論は、 「　4℃　 ∞」気にする必要なし でした。大量に結露すると機械の中が濡れて故障するかもしれないことも含めて、極端な可能性を議論すれば可能性はゼロではないらしいですが、実際には「わからない」程度のことらしいです。メーカーさんの推奨プロトコールでさえ4℃　 ∞と書いてあるそうです。

(無題) 削除/引用 No.12350-28 - 2024/06/04 (火) 13:39:01 - あの >> たぶんあなたは勘違いしていいる 御指摘の通りです。お恥ずかしい。　室温放置はやめときましょう。 とはいえ、 　 　4℃　 ∞ もやめておいた方が、機械が長持ちすると思います（たぶん）

(無題) 削除/引用 No.12350-27 - 2024/06/04 (火) 12:49:09 - G25 >詳しい方の御意見をうかがいたいところですが、次のように室温で長時間放置しても大丈夫というプルーフリーディング酵素ありますね。 そんなことどこに書いてるんだろうと思って読んでみたけれど、 たぶんあなたは勘違いしていいる。 ホットスタート酵素仕様で、一旦高温にさらされるまでは、ポリメラーゼ活性も3'エクソヌクレアーゼ化性もブロックされているから、反応液をセットしてサーマルサークルにかけるまでのあいだ、室温に長時間おいても大丈夫というのを誤解したんじゃなかろか。反応液調製中の氷水浴なんか必要ないし、サンプル数が多くても慌てず落ち着いて準備できるってんでしょ。 校正活性のある酵素は、活性をブロックしておかないと、プライマーや一本鎖の鋳型が分解されるんです。プライマーの3'が削られちゃうと特異性が下がってしまったりする。 反応終了後はもちろん酵素活性は生きてますから、酵素活性のある温度なら3'末端を削ります。 実際は基質dNTPが十分な濃度であるときはexo活性で3'を削る反応とpol活性で埋め戻す反応がアイドリングしている状態。やがてdNTPの濃度がKdより下がると3'を削る一方になる。 PCRで実際どのくらい問題起こすかはわかりませんが、 T4 DNA polやKlenowで末端平滑化する古典的な手法でも注意点として強調されるところです。反応時間が長すぎると削り込みに転じて、かえって末端がガタガタになる。

(無題) 削除/引用 No.12350-25 - 2024/06/04 (火) 12:14:26 - あの ＞＞プルフリーディング能力がある酵素では末端削れたりしないだろうか。 詳しい方の御意見をうかがいたいところですが、次のように室温で長時間放置しても大丈夫というプルーフリーディング酵素ありますね。 https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300751 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/pcr/pcr-enzymes-master-mixes/platinum-high-fidelity-pcr-enzyme.html もちろん使用目的にもよるでしょうし、推奨する訳では決してないです。自分ならしませんし。

(無題) 削除/引用 No.12350-24 - 2024/06/04 (火) 00:18:15 - SYBR master >[Re:7] わたるさんは書きました : > 仰るようにGenomic DNAです。魚の鰭切片からDNAを抽出し使用しております。 えーっと、魚の鱗って魚種にもよりますがグアニン豊富ですよね、たしかグアニン結晶が鱗のキラキラを形成している(構造色?)だったと記憶していますが、違いましたか？グアニンそのものは水に難溶だったので、DNA抽出過程で最初の残渣沈殿等で取り除けそうですが(本当か？）、DNAの抽出方法次第でエタチンぐらいなら核酸と挙動一緒になる気もする。UV吸光で濃度測定するときに、夾雑物として濃度測定に影響与えませんかね。 取りあえず、PCRが走るかどうかは合成したprimerの長さにもよりますが、私も数ヶ月で壊れている可能性は低いと経験的に思いますので、gDNAが必要量無い場合PCRは掛かりにくいと思います。UVで濃度測定した(Nanodropとか)場合DNAとRNAの区別は出来ませんし、核酸の濃度が正しくない可能性があることは、蛍光で計る機械(ThermoのQubitとか）で比較した例が、結構海外でも出回っており、此所の点を私は危惧します。なので、G25さんも指摘しているように、濃度が正しくない理由として夾雑RNAの可能性もあるので、電気泳動で濃度の測定値が正しいかどうか(目安でしか無いですが)、確認してはいかがでしょうか。 あと、鱗からDNA取ったこと無いのでよく解らないのですが、どれくらいの鱗数からどれくらいのDNA取れるんですか？ヒトだと1 copy(1 n)=約3 pgなのですが、体細胞が2nとして15 ngだと最低でも2.5x10^3細胞必要です。魚類はゲノムDNAデカい(たしかヤツメウナギとか染色体数で100本くらいのもあったような物もいた記憶だけ有る)の多いのでこれより細胞少なくなると予想されます。そうするとPCRで安定的に走るコピー数(10^3 copies, 個人的には10^4 copies有ればなお良いと思う)を下回る可能性まで出てきます。また、簡易DNA抽出だと結構crudeなDNAに為りやすいので必要なコピー数は増えますので、キレイなDNAに比べるとPCRは上手くいかないことがありますよ。

(無題) 削除/引用 No.12350-23 - 2024/06/03 (月) 22:39:58 - おお >[Re:21] あのさんは書きました : > 直接の回答ではありませんが、最後の > > 　4℃　 ∞ > > は、機械を長持ちさせるために、やめた方がよいと思います > （古い知識かな？）。 > > 冷やしたいなら、 > 　25℃　１秒 > > でよいです。 > > 理想的には、反応終了したら反応産物をすぐに保管ですが、おおくの場合、一晩ほっておいても大丈夫だと思います。 プルフリーディング能力がある酵素では末端削れたりしないだろうか。

(無題) 削除/引用 No.12350-22 - 2024/06/03 (月) 18:02:13 - 准教授 TS さんの質問に似た初歩的な質問ですが、先輩や他の実験ではきちんと増幅されるんですよね？？あなたしかPCR を使っていないならPCR が壊れたと言う理由もあり得ると思います。こう言うシンプルな理由もあなどれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.12350-21 - 2024/06/03 (月) 17:53:35 - あの 直接の回答ではありませんが、最後の 　4℃　 ∞ は、機械を長持ちさせるために、やめた方がよいと思います （古い知識かな？）。 冷やしたいなら、 　25℃　１秒 でよいです。 理想的には、反応終了したら反応産物をすぐに保管ですが、おおくの場合、一晩ほっておいても大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12350-20 - 2024/06/03 (月) 13:19:36 - おお あ、あとタッチダウンは最初のサイクルのアニーリング温度を高く設定して（Tm＋５以上）、サイクルを追うごとにアニーリング温度を下げていく方法です。最後のサイクルで従来のアニーリング温度より数度低めになるぐらい、あるいは５０度あたりになるように設定する方法です。 https://bento.bio/resources/thoughts-notes-and-ideas/touchdown-and-stepdown-pcr/ For example, if you would normally use an annealing temperature of 54 °C, a touchdown PCR may start with an annealing temperature of 60 °C and drop down 1 °C /cycle over 10 cycles, and then continue at 50 °C for a further 30 cycles. バリエーションもあってアニーリングの温度を数回高い温度でやって、あとは通常のサイクルの設定みたいなのもあるみたいですが、高い方から低い方で勾配をつけてやれば、たいていのプライマーセットで同じサイクルの設定でできてしまうので、条件設定とかあまり深く考えずにそれでやることも多いです。

(無題) 削除/引用 No.12350-19 - 2024/06/03 (月) 13:07:43 - わたる おおさん　ありがとうございます。 機会が94度付近に上がってからセットするということですね。理解悪くて申し訳ございません。そのやり方も併せて試してみようと思います。 プライマーのほうも今一度確認しようと思います。 たくさんのご助言感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.12350-18 - 2024/06/03 (月) 12:54:35 - おお >[Re:14] わたるさんは書きました : > おおさん　ご助言ありがとうございます。 > > 現在行っているPCRのプロトコルを以下に示します。 > > 95℃ ３分 > > 95℃ 15秒 > 52〜60℃ 15秒 > 72℃ 5秒　　←35サイクル > > 72℃ 1分 > 4℃　　　 ∞ > > おおさんの仰るやり方がこの方法なのか自分では判断がつかないのですが、酵素の説明書にかいてある通りに設定して行っていました。 言いたかったことはヒートブロックが９４度になった状態で、チューブをセットするということです。サーマルサイクラーの初期設定はスイッチ入れたら２５度に合わせてくれる用になっているものもあるので、その状態でチューブを入れない。スタートさせて９４度になってからチューブをいれるか、初期設定を９４度に変えるか。 まあプライマーの方も気になるには気になります。濃度とか原液の濃いやつとか、なんか間違えている可能性も一度確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.12350-17 - 2024/06/03 (月) 12:29:43 - G25 プライマーなんて数百円くらいなもんなんだから、 トラブったときはそれが原因かどうかわからなくたって新調すればいいのにと思う。 以前、さんざんトラブルシュートをあれこれ試してだめで、最後にプライマーを新調したら一発で解決した経験があります。凍結ストックから希釈し直したのだからプライマーは問題ないはずと思い込んでいたし、ストック溶液がたくさん残っていたからモッタイナイと思って、新調をためらったがために時間を無駄にしました。 別のプライマーセットでやってみて、それなら増えるという結果がでたら、 プライマーの問題の可能性が高いから、 その結果を携えて指導教員に進言したらいい。 増えなかったら、、、他に（も）原因があるわけですね。

(無題) 削除/引用 No.12350-16 - 2024/06/03 (月) 12:26:25 - わたる G25さん　ご助言ありがとうございます。 ご指摘の通り、以前成功していたのに今はうまくいかない事が、私も不可解に思っています。やはりプライマーに問題があると思っています。 別のプライマーペアで増幅がみられるか確認してみて、見られるなら今使っているプライマーに問題があると考えられる　として指導教員に掛け合ってみようかと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12350-15 - 2024/06/03 (月) 12:07:42 - G25 プライマーの劣化の可能性は否定できないと思ます。 というか、最初に疑って然るべきことの一つでしょう。 駄目になるときには、いきなり駄目になったりするものです。 以前は成功していたというのだから、 いまさら反応条件をいろいろいじったからといって解決する問題ではないでしょう。 そういう微妙な違いではなく根本的、致命的なエラーが起こっていると思います。 >現在自分が使っているプライマーは一組なく、ほかのプライマーは試したことがありませんでした。ユニバーサルプライマー？などで増幅を確認すればよいのでしょか（勉強不足で申し訳ございません） 同じ標的を増やすペつのプライマーセットじゃなくて、全く別の標的配列に対するプライマーでいいんです。研究室で扱っている遺伝子はそれ一種類だけということはないんでしょう？　他のメンバーが扱っている遺伝子のプライマーでもわけてもらえないかい？ >テンプレートDNAのほうは分光光度計を用いて吸光度をそくていし、純度の高いものを使用しています。（新しく抽出しなおしたりしています）またテンプレート濃度は 15ng/ulになるよう調整し、PCRにおいては1ul使用しています。 別の話として、 吸光度による定量はあてにしすぎないように。 夾雑物質に干渉されやすく、特に微量の核酸は不正確になりがち。 鱗みたいな材料中のDNA量が少なく精製の難度の高そうな材料ならなおさら。 吸光度で見積もったDNA量より遥かに微量、ひどければ全く皆無かもしれない。 想定より微量だとしても、PCRだからあれば増えるでしょうけど。 別のプライマーセットでやってみて問題なく増えるならこの可能性は排除されます。

(無題) 削除/引用 No.12350-14 - 2024/06/03 (月) 12:03:24 - わたる おおさん　ご助言ありがとうございます。 現在行っているPCRのプロトコルを以下に示します。 95℃ ３分 95℃ 15秒 52〜60℃ 15秒 72℃ 5秒　　←35サイクル 72℃ 1分 4℃　　　 ∞ おおさんの仰るやり方がこの方法なのか自分では判断がつかないのですが、酵素の説明書にかいてある通りに設定して行っていました。 （念のため説明書のリンクも載せておきます） https://n-genetics.com/files/co/Documents/manual/kapa_13984.pdf 沢山のご助言大変感謝しております。 まだなにかアドバイス頂けるようでしたら宜しくお願いいたします。

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