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(無題) 削除/引用 No.12348-13 - 2024/06/03 (月) 20:59:40 - おお >[Re:12] トンマージさんは書きました : > 皆さんいろいろありがとうございます。 > RIPAにこだわっていたのは、この後タンパク質発現量の測定も想定しておりました。 それならPBSなどで懸濁して10分の1でも3分の1でもタンパク用にとってタンパク用は遠心するなりしてRIPAに懸濁するか、同量とかのRIPAを加えるか(1/2RIPAでも十分抽出できるはず、なんなら2xRIPA作っておいてもいい)すればいいんじゃないか？

(無題) 削除/引用 No.12348-12 - 2024/06/03 (月) 17:34:54 - トンマージ 皆さんいろいろありがとうございます。 RIPAにこだわっていたのは、この後タンパク質発現量の測定も想定しておりました。

(無題) 削除/引用 No.12348-11 - 2024/06/03 (月) 14:51:58 - TS >そうですよねぇ。論文をいくらか紹介しているんだけど ちゃんと見てませんでした。ほんとですね。 手持ちのサンプルでどうにかしたいとかでない限り（限外ろ過しようとしているのでタンパクを見たいような感じはしませんね）、界面活性剤の添加はめんどくさいことにしかならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12348-10 - 2024/06/03 (月) 14:41:54 - おお >[Re:9] TSさんは書きました : > 個人的には、細胞をPBSや遠心で回収後、超音波やポリトロンで破砕して、除タンパクすればよいような気がしました。あるいは、回収した細胞に直接メタノールとかでも細胞は破砕できるし、MSにもっていきやすい気がしました。 そうですよねぇ。論文をいくらか紹介しているんだけどなぜRIPAにこだわるのか、、、同時に蛋白をWBするとか考えているんでしょうかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.12348-9 - 2024/06/03 (月) 14:23:58 - TS Caco-2細胞の細胞内アミノ酸を測定したいだけなんですよね。 これから再試験するように感じたのですが、RIPAが必要ですか。 細胞内アミノ酸はLC-TOF-MSで測ったことはなく、血清中のアミノ酸をLC/MS/MS（四重極）で測定とか、細胞内の有機酸をLC/MS/MSで測定、とかならやっています。見当違いならすみません。 細胞内アミノ酸を測定するための一般的なサンプル調製法を少し探されてはどうかと思います（たぶんすぐに見つかる）。 個人的には、細胞をPBSや遠心で回収後、超音波やポリトロンで破砕して、除タンパクすればよいような気がしました。あるいは、回収した細胞に直接メタノールとかでも細胞は破砕できるし、MSにもっていきやすい気がしました。乾固・再溶解も基本的に必要ないように感じますが、必要ならできると思います。

(無題) 削除/引用 No.12348-8 - 2024/06/03 (月) 12:09:37 - トンマージ おおさん RIPAで溶かしたあとに、まずはAmicon処理をかけたいと思います。 Amicon処理前に、内標準物質も加えて処理をおこない、遠心分離した液を乾固し、再溶解後にフィルターろ過しようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.12348-7 - 2024/06/03 (月) 11:23:40 - おお >[Re:6] トンマージさんは書きました : > 皆さん色々ご指摘ありがとうございます。 > > サンプルの調製の中でも、除蛋白の処理を適切に処置できなかったと反省しております。 > > 一度Amicon処理を行いたいと思います。 方法論としてありだろうけど、.４ミクロンのフィルターで詰まってますよね。。。RIPAで溶かしたあとで考えているのでしょうか。。。まあそれでもDNAとか結構でっかい分子があるし。

(無題) 削除/引用 No.12348-6 - 2024/06/03 (月) 10:54:13 - トンマージ 皆さん色々ご指摘ありがとうございます。 サンプルの調製の中でも、除蛋白の処理を適切に処置できなかったと反省しております。 一度Amicon処理を行いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12348-5 - 2024/06/03 (月) 07:47:10 - おお 指摘がありますけどNP-40やTriton X-100はペプチド（蛋白を解析するためにトリプシンなどで切ったものなど）を分析するじゃまになるので、使わないか除く処理をします。エタノールで抽出するともろに溶け出てくると思います。 ＞�@ 上手く破砕できていなかった RIPAを使ったなら細胞の膜はほぼ完全に可溶化され内容物はかなり抽出されているはずです。 ＞�A 白く濁っていた時点で、溶解するための液量を増やすべきだった たぶん�@の段階で不必要なもの（過剰なタンパク質とか）が溶出されたためエタノールで再溶解したときにそういうものが懸濁してきて除くのが難しくなったと思われます。RIPAはすでにお示しした論文などからおすすめしませんが、RIPAに溶けたものであれば、一度除蛋白などの操作を行うとすんなり行くかもしれません。ただそれで正確にアミノ酸を定量できるはよくわかりません。C13ラベルしたものをサンプルに混ぜて抽出すれば内部標準が取れるかもしれませんけどね。 ＞�B フィルターろ過に問題あり おそらくそこでないと思います。サンプルの調製、プロセスの問題と思われます。 ＞圧力も若干2程度上昇し、 カラムに負担をかけないよう心がけましょう。プレカラムとかつけているならその交換でなんとかなるかもしれませんけど。サンプルがカラムに負担をかけそうなときや夾雑物がおおいいときはsekpack 18の使い捨てのcolumnを使って必要なフラクションを溶出してLC-MSに持っているということもよくやられています。 RIPAの溶液もアセトニトリル、メタノール、TFAなどを加えて遠心して上澄をsekpack 18にのせ適切な条件で溶出するというのはできなくもないかもしれません。ただアミノ酸分析のとき普通そうするか知りませんので、ちゃんと分析できるか私はわかりません。

(無題) 削除/引用 No.12348-4 - 2024/06/03 (月) 03:11:28 - おお https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/975506/#:~:text=Among%20the%20methods%20used%2C%20disruption,half%20of%20the%20intracellular%20pool. 古いし読めんかったけどこんなのも。

(無題) 削除/引用 No.12348-3 - 2024/06/03 (月) 02:15:32 - おお To facilitate cellular disruption and protein precipitation, 1 mL of an ice-cold 2:1:1 methanol: acetonitrile: water extraction solvent was added to each cell pellet and vortexed for 30 s. https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-022-03993-w

(無題) 削除/引用 No.12348-2 - 2024/06/02 (日) 14:34:42 - qq 今どきのアミノ酸の定量はLC-TOFMSで分析するのですか（？） ところで細胞内のアミノ酸と強調していますが、あなたの方法だと細胞外（培地）のアミノ酸をほとんど除去できるのでしょうかね？ ＞細胞をRIPA Bufferで回収し、 操作の詳細がよくわかりませんが、RIPAで抽出するのはあまりおすすめできないような気がします。 界面活性剤を除去するのはなかなか大変なのではないでしょうか？

細胞内のサンプル調製 削除/引用 No.12348-1 - 2024/06/02 (日) 13:49:15 - トンマージ いつもお世話になっております。 Caco-2細胞内のアミノ酸を定量したいのですが、細胞をRIPA Bufferで回収し、破砕後、遠心した上清液を回収しました。 上清液を乾固した後に、エタノールで再溶解しました。 その際に、再溶解液が若干白く濁っていたので、念のためフィルターろ過をしました。（フィルターろ過が硬く押せなくてうまくろ過できなかったかもしれません） そこまで白く濁った感じは変化しませんでしたが、実際にLC-TOF-MSにサンプルを打ったところ、測定終了以後、baseから明らかに普段とは見えないクロマトが検出され続けております。 圧力も若干2程度上昇し、サンプル調製が良くなかったのではと思っております。 細胞内のサンプルをうまく調整できなかったと考えております。 �@ 上手く破砕できていなかった �A 白く濁っていた時点で、溶解するための液量を増やすべきだった �B フィルターろ過（0.45 µm）に問題あり 他に考えられる原因はありますでしょうか。

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