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(無題) 削除/引用 No.12345-11 - 2024/05/30 (木) 16:35:36 - eiger おお　様 > それなら融合せずにYour geneーIRESーGFPのようなコンストラクトがいいのかもしれません。どうしても局在もみたくて融合にしたくて導入の効率も見たいならYour geneー蛍光タンパク（緑以外）ーIRESーGFPみたいにしますか？融合するほうが緑でIRES以下が他の色でもいいでしょうけど。 アドバイスをありがとうございます。 IRESについて詳しく知らなかったため、大変勉強になりました。 特に局在を見る予定はないので、gene-IRES-GFPのコンストラクト作製を視野に入れて進めていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12345-10 - 2024/05/30 (木) 12:06:18 - おお >[Re:8] eigerさんは書きました : > おお　様 > > ご回答いただきありがとうございます。 > 現在目的タンパクのC末にGFPタグをつけているですが、GFPタグをN末に変えたり、そもそも他の蛍光タンパク質に変更したりすることで発現が回復する可能性はあるでしょうか？ N末にして可能性がないとまでは言いませんが、その蛋白の性質をもったGFP融合蛋白ができるわけですからそれならどこにつけても代わりがない可能性のほうが高いような気がします。また局在が限られているとちょっと見にくくなる場合も多いと思います。 それなら融合せずにYour geneーIRESーGFPのようなコンストラクトがいいのかもしれません。どうしても局在もみたくて融合にしたくて導入の効率も見たいならYour geneー蛍光タンパク（緑以外）ーIRESーGFPみたいにしますか？融合するほうが緑でIRES以下が他の色でもいいでしょうけど。 CagFbFPとかいう蛍光タンパクも出ていてこれがいま一番小さいのかな、、、11.6 kDaらしい。融合するのはちっさいほうがいいだろうし。 https://www.genscript.com/protein-news/a-newly-discovered-fluorescent-reporter-protein-could-help-cells-shine-brighter.html 注意点はIRESの前の遺伝子の影響をいくらか受けます。IRESの前に非常に長いORFをつけたら（１０kbpぐらい）結構暗くなったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12345-9 - 2024/05/30 (木) 11:08:31 - eiger み　様 ありがとうございます。 >標的蛋白の内在蛋白は抗体で検出できるものか？ 抗体を用いて検出可能のようです。 ＞局在はどこか分かっているのか？ 転写因子で、核質およびゴルジ体に局在します。

(無題) 削除/引用 No.12345-8 - 2024/05/30 (木) 11:03:04 - eiger おお　様 ご回答いただきありがとうございます。 実験の都合上、できるだけ目的タンパクに変異は導入したくはないのですが、他に発現量を上げる方法はあるでしょうか。 現在目的タンパクのC末にGFPタグをつけているですが、GFPタグをN末に変えたり、そもそも他の蛍光タンパク質に変更したりすることで発現が回復する可能性はあるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12345-7 - 2024/05/30 (木) 07:39:37 - み コザックがあってフレームを問題なく、しかもインサート1.4kb程度ならGFP空ベクターと同様にトランスフェクトは上手くいっているはず。 蛍光顕微鏡のある程度高倍率で蛍光が見られないなら、蛋白発現が上手起っていないか、そもそも低発現、核小体など限局していて見落としている、分解が激しい？ 標的蛋白とGFPの間で切断しても普通に光りそうだしなあ。 標的蛋白の内在蛋白は抗体で検出できるものか？ 局在はどこか分かっているのか？ あとPFA固定すると蛍光が弱くなるかな。

(無題) 削除/引用 No.12345-6 - 2024/05/30 (木) 02:24:26 - おお プラスミドのクオリティーが一緒でコンストラクトに間違えがなければ、トランスフェクションは成立しているでしょう。 融合した蛋白は細胞内でクレアランスなどの制御を受けるので必ずしもGFPと同レベルというわけでもないです。まあ悩ましいところではあります。目的の蛋白の機能を潰した変異を導入するというのも手です。変異によっては蛋白の安定性が変わることもありますけど。

(無題) 削除/引用 No.12345-5 - 2024/05/29 (水) 23:20:06 - eiger ご回答頂きありがとうございます。 ＞目的蛋白はGFPの前、後ろどっちに融合されているのか？ GFPの前に融合されています。 ＞コザック配列のようなリボソームが認識するサイトがあるのか？ CMVプロモーターと目的遺伝子の間にコザック配列があります。 ＞目的蛋白のcDNAは何キロベース？ 1.4kb程度です。

(無題) 削除/引用 No.12345-4 - 2024/05/29 (水) 22:05:39 - み 目的蛋白はGFPの前、後ろどっちに融合されているのか？ コザック配列のようなリボソームが認識するサイトがあるのか？ 目的蛋白のcDNAは何キロベース？

(無題) 削除/引用 No.12345-3 - 2024/05/29 (水) 18:43:22 - eiger ご回答いただきありがとうございます。 発現ベクターの配列については、シーケンスを読んで問題ないことを確認しています。 GFPタグ付きタンパク質だとそこまで蛍光が弱くなってしまうのですね。 蛍光実体顕微鏡でしか確認していないので、GFPの蛍光が弱くて肉眼では見えていない可能性はあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12345-2 - 2024/05/29 (水) 17:04:34 - TS 発現ベクターのシーケンスなどが正しく作れていることを前提ですが、GFPタグ付きタンパク質は、GFP単独よりも発現量が少なくなることが多いです。また、立体構造の問題で蛍光が弱くなっている可能性もあると思います。わたしの経験的には、顕微鏡で観察したとき、GFP単独の1/10とかの蛍光しか見えなくても不思議ではないと感じます。WBをやればもう少しわかるかもしれません。

トランスフェクションがうまくいかない 削除/引用 No.12345-1 - 2024/05/29 (水) 16:19:50 - eiger いつも参考にさせて頂いております。 腎がんの培養細胞株（接着細胞）に、GFPタグ付きタンパクの発現ベクターをリポフェクション法でトランスフェクションしています。 コントロールとしてGFPのみの空ベクターのトランスフェクションも行っており、こちらはトランスフェクションの成功をGFPの蛍光で確認しています。 ところが、目的のタンパクを含む発現ベクターの方は、何度トライしてもGFPの蛍光が全く認められません。別の腎がんの培養細胞株でも試したのですが、結果は同じでした。 これは、発現ベクターがそもそも細胞内に取り込まれていないのか、取り込まれているもののタンパク質として発現できていないのか、どのような原因が考えられるでしょうか。 また改善策などあれば併せてご教示いただけますと幸いです。

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