全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12343-11 - 2024/06/13 (木) 22:52:13 - SYBR master >[Re:10] ｄｄｔさんは書きました : > sgRNAの合成は外注したので、間違ってはいないと思います。同じところで依頼したほかのsgRNAがワークしなかったことはないです。切断実験用PCRで使用したtemplateのDNAは、別件で同じprimerでPCR、シークエンスして、配列は確認しています。特に変異もありませんでした。２回実験を行って、再現性は確認しているので、PCR時の変異というのも考えにくいと思っています。 なるほど、ぼく自身先にも書きましたが始めたばかりなのですが、全く切れなかったのは、「targetの方に問題がある」or 「sgRNAに問題がある」と考えていましたが、別個に何か問題があるのかもしれません。「切れなかった」というネガティブなデータは、過去の表現系が出ないKO mouseの時もそうですが、あまり表面化しないのでデータを集め、その集約には結構大変そうです。 こういうとき、手持ちでSanger sequence出来る(4色蛍光のABI310 or 3100)と、何が問題かのデータを集めやすいんですけど、現状手持ちには無く全部外注なので、sequence決定に結構躊躇するんですよね。また学内の遺伝子センターで3100持っているのに外注より価格が高いので、さらに躊躇しやすく成っているんですけど。 > 別の遺伝子で何度かsgRNAをデザインして切断を見たことがあるのですが、効率の差はあれど、全く切れないということがなかったので、原因は何だろうかと思いました。 もしこれらの事が、単なる「targetの方に問題がある」or 「sgRNAに問題がある」だけで無く、手技的な問題もクリアーした場合、CRISPR/Cas systemに関連して非常に面白いテーマになるかもしれません。なぜならCRISPR/Cas systemは、特定の配列を「切断できないので」排除する機構を持っていることになりますので。ただ、一からそれを探すとなるとPAM上流のtargetが20bpとして、4^20の組み合わせ、すなわち10,099,511,627,776個(あは、10兆越えている)の遺伝子配列で検証したデータで判断しなくては成らないので、現状その解明は予算的に不可能な気がします。 「切れなかった」というネガティブなデータを集めたをデータベースを作れば、(データ量に依存はしますが)predictすることが可能なデータベースは出来るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12343-10 - 2024/06/13 (木) 10:37:08 - ｄｄｔ >[Re:6] SYBR masterさんは書きました : > 切れなかった可能性として、 > 1. sgRNAを化学合成していない場合(PCR系で作成してin vitro転写(IVT)かな）、sgRNAの配列は本当に正しいの？TakaraやNEBのsgRNA作成キットだと、sgRNAの配列正しいかどうかって、cloning and seqeunceしないと、確定できないけど大丈夫？ sgRNAの合成は外注したので、間違ってはいないと思います。同じところで依頼したほかのsgRNAがワークしなかったことはないです。切断実験用PCRで使用したtemplateのDNAは、別件で同じprimerでPCR、シークエンスして、配列は確認しています。特に変異もありませんでした。２回実験を行って、再現性は確認しているので、PCR時の変異というのも考えにくいと思っています。 別の遺伝子で何度かsgRNAをデザインして切断を見たことがあるのですが、効率の差はあれど、全く切れないということがなかったので、原因は何だろうかと思いました。特に、問題のsgRNAはどこのsgRNAデザインサイトでもそれなりにoff-targetの少ないscoreがでていて、ほかのデザインはいまいちだったので。

(無題) 削除/引用 No.12343-9 - 2024/06/05 (水) 15:03:41 - AA chopchopは2014年からあって老舗のアルゴリズムです。歴史の長いやつほどoff-target重視な傾向はあり、chopchopはBowtieを使った配列検索が基本になっていたと思います。ただ、バージョンが進むにつれてノックインモードやらCRISPRa/iモードやら多機能になっているのでon target性能も考慮するようになってきているかもしれません。 効率の程度の差についてですが、PCR産物のin vitro消化が効率良ければほぼ全て消化されるのに効率悪いと消化されないものが泳動後のバンド比で7割残る、という感じのイメージです。切れる切れないの二元論的な結果なら配列依存なんですが、中途半端になるのでやはり配列問題ではないという認識でいます。 でもたしかに、初めに標的配列があるが存在することを確認してから進めるのが丁寧で科学者的ですね。

(無題) 削除/引用 No.12343-8 - 2024/06/04 (火) 23:06:02 - SYBR master >[Re:7] AAさんは書きました : > MIT spec scoreをはじめとして多くのアルゴリズムがoff-targetに比重があるのは事実ですが、例えばWU-CRISPRなどはspecifictyよりもefficacyに比重をおいたアルゴリズムになっていますし、一概に予測スコア＝配列特異性というわけでもないです。 返信ありがとう。普段はChopChop(ってどっちのアルゴリズムなんだろ）とか使っているんで、生物種はほぼfull-genome確定した物が候補に挙がっているので、ほぼoff-targetに比重を置いている物だと思っていました。 > 1つの遺伝子に3−4種類の候補ガイドRNAを設計し化学合成(＋PAGE精製)で用意した後、単一のPCR産物が候補ガイドの認識配列をすべて含むように設計されたPCR産物をin vitroでRNPと混ぜて消化すると、程度の差はあれど効率に差が出ることのほうが多いです。 この部分、「効率に差は有っても」まるっきり切れないって事は無いんですよね？個人的な経験では、2つの遺伝子に対してChopChopでpredictしたそれぞれ3つのsgRNAのうち、1つの遺伝子に対しては3つとも切れたけど、もう1つの遺伝子は1/3しか切れなかったので、元配列(元のstrainが少し違う)かsgRNA（うちはPCR系で作成している）のどちらかが悪かったと判断しましたが、取りあえず切れる候補があれば良かったので、細かい配列の調査は行っていません。ただ、培養細胞とかは明らかにgenomeに変異が入っているので、その影響ないですかね。 >PCR時にPAM他の配列がエラーを起こしていないかというのも有り得る話ですが、昨今の高正確性酵素を使用して毎度ピンポイントでそこにエラーが入るというのも考えにくいのかなと思います。 現在のPCRで変異が入りにくい事については同意いたしますが、使用した元配列(鋳型)にPAMが実は無かったとか、少し違う配列になっていたとかはあり得ませんか？と言う意味でした。解りにくかったら申し訳ないです。 > また、例えば制限酵素も本来は同様の目的で細菌類が持っている酵素だと思いますが、それぞれ切れ味というのが異なるというのは分子生物学実験に馴染みのある方であればご同意いただけると思いますし、配列による特性というのはやはりあるのではないでしょうか？ なるほど、これについては同意いたします。確かに制限酵素とかだと「切れ易い」「切れ辛い」物はありますね。 少し脳みその中整理して、今後に役立てたいと思います。情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12343-7 - 2024/06/04 (火) 09:36:26 - AA MIT spec scoreをはじめとして多くのアルゴリズムがoff-targetに比重があるのは事実ですが、例えばWU-CRISPRなどはspecifictyよりもefficacyに比重をおいたアルゴリズムになっていますし、一概に予測スコア＝配列特異性というわけでもないです。 また、配列ごとに切れる切れないがあったら獲得免疫として機能しないのでは、というのはご尤もな指摘なのですが実体験としてそういう配列はよくあります。 1つの遺伝子に3−4種類の候補ガイドRNAを設計し化学合成(＋PAGE精製)で用意した後、単一のPCR産物が候補ガイドの認識配列をすべて含むように設計されたPCR産物をin vitroでRNPと混ぜて消化すると、程度の差はあれど効率に差が出ることのほうが多いです。PCR時にPAM他の配列がエラーを起こしていないかというのも有り得る話ですが、昨今の高正確性酵素を使用して毎度ピンポイントでそこにエラーが入るというのも考えにくいのかなと思います。 また、例えば制限酵素も本来は同様の目的で細菌類が持っている酵素だと思いますが、それぞれ切れ味というのが異なるというのは分子生物学実験に馴染みのある方であればご同意いただけると思いますし、配列による特性というのはやはりあるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12343-6 - 2024/06/04 (火) 01:52:02 - SYBR master >[Re:1] ｄｄｔさんは書きました : > ２つのデザインのうち、1つはちゃんと目的の位置で切断されていたのですが、もう１つは全く切断されていませんでした。sgRNAのデザインスコア自体は、切断されなかったデザイン方が高かったのですが、このように全く切断されないということはあるのでしょうか。 ぼく自身、Cas9系の実験始めたばかりなので勉強不足な部分はあるのですが、このin silicoでのデザインスコアって、標的生物のoff-targetの可能性を示唆する物では無いんですか？切れ安いかどうかは考慮されていないはずですけど。配列によって切れないとか、CRISPR/CASのシステム(DNA配列を介した免疫だよね)から考えるとあり得ないと思うんだけど、違うのかな。もし切れない配列が存在するとしたら、微生物が最初の外部DNA認識の時に、「これは切れる、だけど、これは切れない」という認識システムが存在し無いと、CRISPR/CASのシステムによる免疫が成り立たなくなるんだけど。 切れなかった可能性として、 1. sgRNAを化学合成していない場合(PCR系で作成してin vitro転写(IVT)かな）、sgRNAの配列は本当に正しいの？TakaraやNEBのsgRNA作成キットだと、sgRNAの配列正しいかどうかって、cloning and seqeunceしないと、確定できないけど大丈夫？DNAの長さだけ(IVTによる、sgRNA鋳型DNAってT7含めて130bp位で、転写されるsgRNAは100 base前後だっけ)では正しいかどうかの判断って、電気泳動だけではかなり難しいよ（ってか、アガロースゲルだと4％でも無理でしょうから、一々PAGEする？)。 2. PCRで標的DNAを増やした場合、本当に正しい配列増やせたの？strain変わるだけで、genomeの配列(いわゆるSNPだけど)、特に培養細胞とかだと結構違うんだけど、これまた正しい配列かどうか、cloning & seqeunceしないと行けないけど、PAMは保存されていた？Cas9だと20 baseの標的に対して、PAM上流の10 base位が完全一致しないと切れないことがあるって勉強したけど、そこは大丈夫？ 個人の意見としては、いちいちclonig and sequenceをしたくないから、標的遺伝子に対して3-4個の候補sgRNAをPCR系キットで作成して、かつ標的細胞からPCRで作成したDNAを切れるかどうか判断したあと(切れないsgRNAとか深追いしない）で実細胞に投入、がこのCas9系の実験のお作法だと思っていたんですけど、違うんですかね。 もし間違っている部分有るなら、よりよく勉強したいのでご指摘お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12343-5 - 2024/06/03 (月) 09:08:26 - ｄｄｔ なるほど。参考になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12343-4 - 2024/06/01 (土) 01:48:04 - おお >[Re:3] ｄｄｔさんは書きました : > ありがとうございます。 > PAM近傍のターゲット配列に合うsgRNAを使っても、必ずしもCas9がそこに結合して切断するとはかぎらない限らないということですね。 > となると、逆にsgRNAのスコアが悪くても、実際に入れてみたら編集効率がいいということもあるのでしょうか。 まあ予測ですからね。。。で普通スコアが悪かったら選ばないだろうけど。ただ２つ選んで高いスコアのほうが効率悪かったというのは割とあるんじゃないかな。 また、sgRNAについては詳しくわからないけど、siRNAなどの予測は複数のアルゴリズム（予測方法といえばいいか）があって一方の予測ではハイスコアでよくワークしても他方の予測では引っかかりもしないとかあるし。ただ実際複数アルゴリズムがある場合は両方やって共通するところであれば割とあたっているっていう話もある。

(無題) 削除/引用 No.12343-3 - 2024/05/31 (金) 10:42:27 - ｄｄｔ ありがとうございます。 PAM近傍のターゲット配列に合うsgRNAを使っても、必ずしもCas9がそこに結合して切断するとはかぎらない限らないということですね。 となると、逆にsgRNAのスコアが悪くても、実際に入れてみたら編集効率がいいということもあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12343-2 - 2024/05/29 (水) 13:03:57 - AA どのアルゴリズムもベースにしているデータを取ったときの方法論とことなる方法だと食い違うことは珍しくありません。 大抵のアルゴリズムは培養細胞でのデータを元にしていて、かつCas9/sgRNAも発現させていたりするのでRNPとPCR断片との反応だとかなり実験系が異なります。 予測スコアはあくまで予測に過ぎないということで、私も必ず手元で確認してから本番に進むようにしています

Cas9-sgRNAで目的配列が全く切断できない 削除/引用 No.12343-1 - 2024/05/29 (水) 12:55:45 - ｄｄｔ いつも勉強させていただいています。 ある遺伝子をCRISPR-Cas9で編集するため、sgRNA合成メーカーのサイトを使って、いくつかsgRNAをデザインしました。 切断効率をみるため、目的配列近くのPCR産物にCas9-sgRNA複合体を加えて、37℃1h incubate→泳動してどの程度切断されているか確認しました。 ２つのデザインのうち、1つはちゃんと目的の位置で切断されていたのですが、もう１つは全く切断されていませんでした。sgRNAのデザインスコア自体は、切断されなかったデザイン方が高かったのですが、このように全く切断されないということはあるのでしょうか。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---