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(無題) 削除/引用 No.12338-2 - 2024/05/26 (日) 03:31:32 - おお 分解の可能性があるかもと思っています、コンストラクションに問題がなければ。 なぜそう思うかと言うと、細胞にGFPタグのタンパクを発現した時、一部のタンパクは全長よりもGFP断片がドミナントだったりします、特に細胞やその増殖によってあまり好ましくなさそうなタンパクの場合。GFP が細胞内でプロテアーゼなどに対して(多分)抵抗性があってかなり安定しているのが原因かと思われます。 一度RT-PCRで意図するmRNAが発現しているか確認するのはどうでしょう、EGFP のM末とXのC末あたりにプライマーを設定して(全長でも構わないけど)。

レポーター遺伝子以外のノックイン遺伝子が発現しない? 削除/引用 No.12338-1 - 2024/05/25 (土) 19:40:48 - tomi マウスモデルで、タモキシェン誘導性にCreを使用して、loxpシステムで正の向きで入っているwildtype遺伝子xを不活性化し、逆の向きで入っているmutant遺伝子x配列を反転させ、mutant遺伝子xを発現させることで、生体への影響を調べる実験をしています。 発現する予定のタンパクの元の配列は、mutant遺伝子X-HA-T2A-EGFPになります。 ところが、実際に誘導した所、レポーター蛋白のEGFPはしっかり発現が検出されましたが、肝心の蛋白xおよびHAタグをIHC,WBなどではまったく検出ができず、おそらく発現していません。PCRした所、遺伝子はしっかりと反転できているので、遺伝子の反転の誘導自体はうまくできていると思います。 EGFPは発現しているため、理論的には、同じプロモーターの下にあるmutant遺伝子xおよびHAタグも発現するはずなのですが、目的のmutant蛋白XとHAタグが生体内で検出できない理由は何か考えられますか。

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