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(無題) 削除/引用 No.12322-12 - 2024/05/19 (日) 19:25:52 - み >[Re:10] signalさんは書きました > 以下、真っ先に改善しようと思っている点です。 > > ・６cm　dishに200μlのRIPAを添加する（10�p　dishで系を立てると、刺激時に細胞の確保が難しくなりそうだから。 6cm dishなら300-400ulは必要だと思います。 RIPAだとDNAも抽出されて粘性が強くなり扱いにくくなります。 200だとdish表面全体をカバーできないし、スクレーパーでこそぎ取って集めても、粘ちょうになって蛋白定量時の不安定化や泳動時に糸を引いたり乱れを引き起こす。 まあ、そのためソニケーションやシリンジに通すわけですが、それでも結構糸引くことあるので。 6 well plateに150-200ulの系でも200-300ugの収量が得られるのが普通だから10レーン分の蛋白は得られる計算。 皆がこれだけあれこれ指摘しているにも関わらず、未だに細胞種や細胞数が示されないのであくまで一般的な話しかできません。相当効率の悪いやり取りになっているようです。 コンフルと言っても細胞数が少なかったり、蛋白量が少ない場合は、いったんPBS中でスクレーパーで回収してペレットだけにして、それから少なめのRIPAで抽出するけど。

(無題) 削除/引用 No.12322-11 - 2024/05/19 (日) 17:18:11 - と 皆さんのご意見に同意で、RIPA増量、超音波破砕またはシリンジ処理は必須だと思います。 溶液がマイクロピペットで正確にとれるくらい低粘性でゼリー状のものがない状態でないと、その後の蛋白定量やサンプル調製でバラつきますし、泳動の乱れに繋がることもあります。 私の場合、評価対象が膜蛋白出ない場合は、継代と同じようにtrypsin処理などで細胞を剥がしてから細胞を回収してチューブに回収し、washi処理をした後RIPAを加えていました。スクレーパ使いが苦手なのと、サンプルごとにスクレーパーを洗浄するのが面倒だったためです。他にもRIPAに溶解後のサンプルが高粘性のため、ピペットで回収しようとすると詰まってイライラすることが多かったことも理由の一つです。 wash操作等でバッファー添加、撹拌、遠心、バッファー除去とこちらも工程が増えて面倒ではありますが。 また、薬剤評価などでサンプル数も多くなることから、dishではなく6-well plate場合によってはよりwell数の多いplateを使うこともありました。 ご参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.12322-10 - 2024/05/19 (日) 16:47:08 - signal 皆さま、たくさんのアドバイスを頂き本当にありがとうございます。 以下、真っ先に改善しようと思っている点です。 ・６cm　dishに200μlのRIPAを添加する（10�p　dishで系を立てると、刺激時に細胞の確保が難しくなりそうだから。） ・25G〜30Gのシリンジに何回かサンプルを通す 　（私の研究室は、超音波ホモジナイザーは動物用しかなく容量的に使用できない。超音波槽でソニケーションを行うことは可能ですが、Ｔさんがおっしゃるようにムラができる要因をできるだけ排除したい。） 他にもご意見などがありましたら、ぜひ教えていただきたいです。 皆さま本当にご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12322-9 - 2024/05/19 (日) 16:20:04 - T 1)Lysis Bufferの量が足りないような。自分は重層しない一層の細胞を扱う時でも10cm dishには500ulのRIPA Buffer (にProtease Inhibitorと、リン酸化を見る時はPhosphatase inhibitor cooktailも加えたもの）を使っている。 2)ボルテックスはせず、そのステップでは超音波でサンプル破砕を行っている。これ、超音波槽でやったこともあるけれど、仕上がりがばらつくのでお勧めしない。長い時間やっても粘度の高いのが出来てしまい、それらはよくおかしなバンドという結果になったことがある。超音波ホモジナイザーを使うべき。無ければ代わりに注射針を通す。私は30G程度の細いものでやった。シリンジはそこそこ小さいもの(1mlとか）を使っても結構ロスが出る（シリンジに残ってしまう）。RIPAが50ulだったら半分近く（以上？）ロスするかも。せっかく10cm dish使ってるのだから、やはり500ul程度は使っても良いのでは？（私は6well dishなら50ul/wellでやってます） 個人的には、超音波破砕のステップは必須です。これ無しでやると、遠心後に上清だけとったつもりがダマというかスライミーな塊が残っていたりして、これを誤って（誤りやすい）ゲルに流すと大抵ろくなことがない。あと、この塊を含んだものをBCAアッセイにかけてしまっても、やっぱり再現取れない結果になります。

(無題) 削除/引用 No.12322-8 - 2024/05/19 (日) 16:12:13 - み 既に何度も指摘されていますが、Lysis bufferのボリュームが少なすぎます。 細胞種や細胞数が記載されていないので最適量ははかりかねますが、500-1000マイクロリットルあたりでソニケーションしておけば2-5mg/mlくらいの濃度で回収できるでしょう。 単純計算で収量が2-5mgになります。 前のトピで記載されていた５０マイクロリットルで抽出して、収量が30マイクログラムなんて実験している時点で終わってます。 マトモ方法でやり直しましょう。 冷えた泳動液だの抗体濃度だの言う以前の問題です。 勿論、サンプル調製以降の段階にも不適切な部分がある可能性は否定しません。

(無題) 削除/引用 No.12322-7 - 2024/05/19 (日) 15:17:11 - E > １，10�p　dishコンフルエントの細胞を用意 > ４,50μlのRIPAを添加し、スクワイパーでかき集める➮EPチューブに回収 > ６，4度　15000ｇ で10分遠心 > ７，上清を回収し、サンプルとする。 本当にこの条件でやっていたら遠心後のペレットがだいぶ大きいのではないでしょうか？もったいない。

(無題) 削除/引用 No.12322-6 - 2024/05/19 (日) 14:57:59 - おお >４,50μlのRIPAを添加し、スクワイパーでかき集める➮EPチューブに回収 ５００から１０００μlいると前の質問で指摘しました（リファレンスまで示してよんだかなぁ。。。）。まあ他の方の意見も聞いてみたいのだろうけど。 またRIPAでLysisするとDNAも溶け出てきてドロドロするので、すでに指摘がある超音波でDNAをフラグメント化して扱いやすいようにするとか、２３から２５Gの注射針をシリンジをつけてドロドロするのが解消するまで吸い出しするとか言うやり方もあります。 https://home.sandiego.edu/~josephprovost/RIPA%20Buffer%20Lysis%20Protocol.pdf ここではT-25 flaskにたいして２５０μl. T-25 flaskの細胞が接着する部分の広さ（面積）はメーカーのカタログとかに書いてあるので調べてみればいいと思う。 https://www.alomone.com/info/sample-preparation-for-cell-lines Place the plate on ice and add ice-cold Lysis Buffer D at a ratio of 5 × 10^6 cells/ml Lysis Buffer D. 5 × 10^6 cellsは大体１０cmで５０から７０％コンフルくらいのポピュレーション。バッファーはよりマイルドに作っていてTriton X-100単独。これだとLysateがドロドロにならない（もちろん細胞の状態や量比によるけど）。

(無題) 削除/引用 No.12322-5 - 2024/05/19 (日) 14:54:18 - E > １，10�p　dishコンフルエントの細胞を用意 > ２，以下全てオンアイス > ３，冷やしたPBSでwash > ４,50μlのRIPAを添加し、スクワイパーでかき集める➮EPチューブに回収 10�pdishコンフルエントで50ulのRIPAは少ないです。EPチューブに回収したあともピペッティングしてほぐしてね。 > ５，15秒ほどボルテックス このあと超音波粉砕かシリンジに通します。必須ではないですが望ましいかな。した方がプロテインも濃くなりますよ。 > ６，4度　15000ｇ で10分遠心 > ７，上清を回収し、サンプルとする。 おおむね標準的な手順だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12322-4 - 2024/05/19 (日) 14:44:19 - s どちらでもよいと思いますが、私は超音波ホモジナイザーで数秒破砕しています。

(無題) 削除/引用 No.12322-3 - 2024/05/19 (日) 14:20:53 - signal sさま 早速のご返信本当にありがとうございます。 超音波は超音波槽で行っていますか。それとも、超音波ホモジナイザーのようなものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12322-2 - 2024/05/19 (日) 14:12:27 - s 私は5の工程のところで、超音波でサンプルを破砕しています。

WB　サンプル調整方法のアドバイスをください 削除/引用 No.12322-1 - 2024/05/19 (日) 14:10:23 - signal 初めまして。 WBの立ち上げを行っている大学院生です。 昨日、WBが上手くいかないということをこの掲示板で相談させていただき、たくさんのアドバイスを頂くことが出来ました。 その中で、WBのサンプル調整の段階が一番問題なのではないか、と思いました。そこで、自身のサンプル調整法に関してアドバイスやご意見などを頂きたいと思い、新たに掲示板を立ち上げさせていただきました。 以下、私のサンプル調整法です。 １，10�p　dishコンフルエントの細胞を用意 ２，以下全てオンアイス ３，冷やしたPBSでwash ４,50μlのRIPAを添加し、スクワイパーでかき集める➮EPチューブに回収 ５，15秒ほどボルテックス ６，4度　15000ｇ で10分遠心 ７，上清を回収し、サンプルとする。 どんなことでも構いませんので、アドバイスやご自身の方法などを教えていただきたいです。よろしくお願いいたします。

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