初めまして。閲覧いただきありがとうございます。
研究室でWBの立ち上げを行っている大学院生です。
トピックの題名にあるようにWBが成功したり、全くバンドが見えなかったりと安定しません。試せる手は全て試してみたのですが、それでも解決しないため何か別の見方や考え方はないか、と質問をさせていただきいております。
以下、現状です。
・サンプル⇒細胞10cmdishに50μlのRIPAバッファー（BSA法でタンパク量を測ったところ、１wellあたり３０μgのタンパク量になっています。）
・SDS-PAGE⇒まっすぐバンドが進むときもあれば、スマイリング、逆スマイリングなどバンドが曲がってしまう時もある
・転写➮セミドライで行っています。有色マーカーが転写されたことを確認し、終了しています。（メンブレン、ゲルの平衡化という概念を始めて知ったため、まだ平衡化は行ったことがありません。）
・ブロッキング➮市販のブロッキング溶液で室温1時間
・一次抗体➮TBSTで1:1000に希釈し、4度でO/N
・二次抗体➮1:50000で室温1時間
・検出➮検出感度の高いものを使用（発光検出）
一次抗体、二次抗体、検出試薬は先月購入しています。
上記の試薬、方法で何度もWBを行っているのですが、メンブレン全体が白くなりマーカーしか検出できない、メンブレン全体が黒くなってしまうということが度々起こります。（3回に1回くらいはバンドが確認できますが、なんだかタンパク量の割に薄い気がしています。）（ＷＢの方法は変えていないのにも関わらず、結果がでたりでなかったりと安定しません）
どんなことでも構いませんので、アドバイス、提案などいただけますと幸いです。よろしくお願いいたします。 |
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