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(無題) 削除/引用 No.12320-23 - 2024/05/21 (火) 06:29:57 - あああ 私は、85-120Vで1-2時間ほど通電しています。電流は自然と30mAくらいになっています。 85Vで10分前後（ゲルの上層部） その後100-120Vで1-2時間 （その時のタンパク、ゲル状況、見たいターゲットなどによりその度、変更しています。） あまり機械の設定や物理科学のことはわかりませんが、私はどこのラボでも２００Ｖ　未満で設定しています。電圧が高すぎるとスマイリングが起きやすいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12320-22 - 2024/05/20 (月) 12:46:02 - pp セミドライのブロッティングでゲルが波打ち、メンブレンが白くなるのは blotting bufferが少なくて乾いているように思います。 もう少し足しても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12320-21 - 2024/05/20 (月) 12:13:00 - あの CBB染色なら、転写後のゲルの方をそめればよいです。 メンブレンはCBB染色せずに。

(無題) 削除/引用 No.12320-20 - 2024/05/19 (日) 18:49:54 - おお >[Re:19] とさんは書きました : > WBって簡単そうで奥が深いですよね。 > 私はCBB染色液はナカライのquick stain CBBを使用し… WBで検出まで終わったメンブレンを浸して振盪してメンブレンに転写されてタンパク質を検出し、転写むらが無いかなどの確認をしていました。数時間も振盪すればバンドが染まっているのが確認できますし、染色後は水で洗ってメンブレンを乾燥させるとバックの染色が薄くなりよりきれいな染色像が得られていました。 これができるのはPVDFでニトロセルロースでは無理なんじゃないかと。転写むらを確認するならWBの前にそめた方がとも思うし、そういう染色方法はある。使えないメンブレンでWBしてから、後で転写上手く行ってなかったとか、ガッカリだし。

(無題) 削除/引用 No.12320-19 - 2024/05/19 (日) 17:50:51 - と WBって簡単そうで奥が深いですよね。 サンプルに余裕があるようでしたら、まずはSDS-PAGEのゲルをCBB染色などして、きちんと泳動できているか、レーンごと（サンプルごと）にタンパク量のバラつきはないかを確認して、SDS-PAGEまでは問題ないことを確認してはいかがでしょうか。 サンプル調製がうまく行っていない場合、泳動がみだれたり、蛋白定量自体がうまくいっていなくて、同じタンパク量をのせているつもりがレーンごとに異なっていることがわかったりします。 転写に関してはマーカーは転写効率がいいので、マーカーだけで判断するとダメな場合があります。 WB終了後にメンブレンを染色してみる、転写後のゲルをCBB染色するなどして、うまく転写できていることを確認することも有効かと思います。 転写後のメンブレンを乾燥しない程度水が切れた状態で観察すると、いい角度で見るとCBB染色像のようなバンド（もちろん色はありませんが）が確認できることが多いです。 私はCBB染色液はナカライのquick stain CBBを使用していましたが、ゲル染色液を水とメタノールで希釈したものに、WBで検出まで終わったメンブレンを浸して振盪してメンブレンに転写されてタンパク質を検出し、転写むらが無いかなどの確認をしていました。数時間も振盪すればバンドが染まっているのが確認できますし、染色後は水で洗ってメンブレンを乾燥させるとバックの染色が薄くなりよりきれいな染色像が得られていました。 実験ごとに染まらなかったり、真っ黒になるのは何故でしょうね。よくわかりません。 試薬に問題がなかったり、操作が同じであれば、どちらかの結果が続くような気がするのですが。 一次抗体に関しては、信頼しすぎるのは良くないと個人的には感じています。 シングルバンドで結果が得られたとしても、本来の蛋白ではないものを検出している場合もよくありますし、蛋白の修飾状態により検出したりしなかったりというのもよくあります。 リン酸化状態では検出できなくなる抗体や、修飾に関係なく認識する抗体などの経験があります。 複数の抗体で評価したり、siRNAなどでKD,　OEした細胞なども用意して、目的の蛋白をしっかり認識していることを確認しておくことも重要かと思います。 予算の関係でできないことも多いと思いますが、正しい判断ができるよう実験を進めていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.12320-18 - 2024/05/19 (日) 14:45:13 - E > チューブに入れたサンプルは > ＞＞ご丁寧にありがとうございます。ソニケーションは、超音波槽で行っていますか。可能でしたら、どのくらいの時間ソニケーションを行っているのかお聞きしたいです。 以前は棒状の超音波粉砕機を使っていました。5秒から10秒程度、ジジジジジ・・・という感触があります。あまり強かったり長くやったりすると暖まってしまうので短時間だけ。それをしているときは耳にはイヤホンやヘッドセットをつけます、耳（脳？）の保護ですね。 今の研究室は超音波槽がありますが、ちょっとプロトコールは覚えていません。初めて使う機械で説明書を読むのが面倒だったのでシリンジでやりました。自分で時間を考えろというならば、20-30秒くらいにするかな？お水はアイスを少しいれて冷えた状態で。 > ＞ランニングバッファーはできればキンキンに冷やして > ＞＞初耳でした！ご教示いただきありがとうございます。 > 泳動ボックスを冷やしながら行う際は、箱の底面に氷をひく感じでしょうか。 お魚屋さんで細かい氷の上に高級魚を置いて売られているのがあるじゃないですか。あんな感じで氷の上に泳動槽を乗せる、のではなく、まず平たい箱に泳動槽を入れて、その平たい箱の隙間に氷を入れる感じです。泳動槽の下の方の正面と側面が氷に触れる感じで。氷を先に入れてその上に泳動槽を乗せると安定しませんからね。でも必須というわけではないですよ。バッファーが冷えていたらまぁ大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.12320-17 - 2024/05/19 (日) 14:18:58 - signal あああさま ご返信ありがとうございます。 ＞→どの程度のことを言っているのかわかりませんが、以下4点が上から重要です。 1）バッファーが満たされている。（ゲルとAssemble（Ｂｉｏ-radなら緑のアレです）の間から簡単にもれます。規定以上量のバッファーを入れておくことをお勧めします） 2) 電圧や電流が正しく設定されている。 3) バッファーの組成が違うor古くなっている(古いと電流の数値が低くなるので目安にしてください) 4) ゲルが正しく作られている（スマイリングには関係ないですが、綺麗なバンドを出すためにはかなり重要です） ＞＞電圧や電流はどの程度で流されてるか、可能でしたら教えていただきたいです。私は、20mA、500Vで1時間ほど通電しています。 恐らく、メンブレンが黒くなってしまう原因は検出試薬の感度が高すぎるからだと思います。検出試薬を高感度なものに変えた瞬間、このようになりました。一夫でバンドが出ない理由はサンプル調整に問題があるからではないか、と思い始めています。 たくさんご教示いただき本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12320-16 - 2024/05/19 (日) 14:14:45 - signal Eさま ご返信ありがとうございます。 ＞10cmdishでRIPAバッファーが50ulは少ない気がします。うちでは10cmdishでしたらRIPAバッファーは300から400ul入れてスクレイパーでゴシゴシ集めてチューブに入れます。手早く、あるいはオンアイスで冷たい状態でやります。 チューブに入れたサンプルは（常にオンアイス）ソニケーションするかシリンジに数回通します。遠心してペレット以外の上澄みをプロテインサンプルとして定量します。アプライするプロテイン量は（ターゲットプロテインにもよりますが）30ugは多い印象です。私は10から20ugをスタートで流しますね ＞＞ご丁寧にありがとうございます。ソニケーションは、超音波槽で行っていますか。可能でしたら、どのくらいの時間ソニケーションを行っているのかお聞きしたいです。 ＞ランニングバッファーはできればキンキンに冷やしておいて下さい。できれば泳動のボックス自体を大きめの箱というかトレーにおいて氷を入れて、泳動ボックスを冷やしながら泳動するとキレイに一文字になります。（試しにランニングバッファーを少し温めて泳動してみると、見事にふにゃふにゃになりますよ。時間があればお試しあれ。）ただ多少曲がっていてもあんまり気にしないかな ＞＞初耳でした！ご教示いただきありがとうございます。 泳動ボックスを冷やしながら行う際は、箱の底面に氷をひく感じでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12320-15 - 2024/05/19 (日) 14:03:27 - signal ゲンバさん ご返信ありがとうございます。 先輩方で行っていた方はおらず、指導教員が研究をしていた時代の知識に頼って立ち上げを行っています。 着色マーカー以外のWBマーカーも流しているのですが（マーカーを2種類使用しています）、こちらはバンドが毎回検出できるため、WBの系は走っているのではないか、と考えています。 と、なると、サンプルの問題なのか、と皆さんからのアドバイスをうけて思っております。

(無題) 削除/引用 No.12320-13 - 2024/05/19 (日) 08:41:17 - おお >[Re:5] おおさんは書きました : > >[Re:4] signalさんは書きました : > > ＞＞;転写後のゲルは、熱が強すぎる？のか丸まってしまいますが、これで大丈夫なのでしょうか。 > > 実際に熱は出てるでしょうか？ゲルは20％メタノールで若干縮みます。私は特別事がなければゲルは平衡化せずに転写しますが、その時転写中にゲルが縮まないようにある程度圧が掛かるようにしてます(たいていそうだとおもいます)。ですので転写を終えて中を取り出すと、その時点ででゲルが縮みます。 ちなみにゲルを平衡化せずに、トランスファーをセットしたときゲルにある程度圧がかかってないとき、泳動中に縮んだりして検出感度が落ちることもあります。

(無題) 削除/引用 No.12320-12 - 2024/05/19 (日) 05:09:13 - おお >[Re:7] signalさんは書きました : > 本当にご丁寧にありがとうございます。 > > とにかく、最初のサンプル調整の部分に問題がありそうなので、 > もう一度タンパク定量から見直してみます。 > 主様が主に使っているタンパク質定量は、BCA法でしょうか。 RIPAならBCAでやってます。

(無題) 削除/引用 No.12320-11 - 2024/05/19 (日) 04:34:17 - ? >[Re:1] signalさんは書きました : > ・二次抗体➮1:50000で室温1時間 >[Re:10] あああさんは書きました : > 1) 2次抗体の1:5000を下げてください。 > 個人的には1:1000 or 1:2000で事足ります ？

(無題) 削除/引用 No.12320-10 - 2024/05/19 (日) 02:57:08 - あああ 自分も所属しているラボの第一メンバーになったことが3回あり、立ち上げばかりやっています。 立ち上げは、業績や知識は遅れますが、楽しいし力になります！修行と思って頑張ってください！ ⓵SDS-PAGE⇒まっすぐバンドが進むときもあれば、スマイリング、逆スマイリングなどバンドが曲がってしまう時もある →どの程度のことを言っているのかわかりませんが、以下4点が上から重要です。 1）バッファーが満たされている。（ゲルとAssemble（Ｂｉｏ-radなら緑のアレです）の間から簡単にもれます。規定以上量のバッファーを入れておくことをお勧めします） 2) 電圧や電流が正しく設定されている。 3) バッファーの組成が違うor古くなっている(古いと電流の数値が低くなるので目安にしてください) 4) ゲルが正しく作られている（スマイリングには関係ないですが、綺麗なバンドを出すためにはかなり重要です） ⓶メンブレン全体が白くなりマーカーしか検出できない。 トランスファーは上手くいっていますがタンパクが検出されていません。 1) 抗体種を確認してください（Mouse, Goat, Rabbit etc） 2) タンパク抽出が正しくできているか、確認してください。必要に応じてタンパク濃度を上げてください。脂肪組織などでしたらコンタミ注意です。 ⓷メンブレン全体が黒くなってしまう 過剰ブロッキングによる過剰なバックグラウンドです。 1) 2次抗体の1:5000を下げてください。 個人的には1:1000 or 1:2000で事足ります 2) ウォッシングの時間や回数を増やしてください。 3) ECLですかね？High sensitiveなものを使っている場合は、水などを加えて濃度を下げてください。

(無題) 削除/引用 No.12320-9 - 2024/05/19 (日) 00:16:18 - E > 研究室でWBの立ち上げを行っている大学院生です。 楽しそうですね。頑張って。 > トピックの題名にあるようにWBが成功したり、全くバンドが見えなかったりと安定しません。 成功している場合もあるようですので自信はもってください。 > ・サンプル⇒細胞10cmdishに50μlのRIPAバッファー（BSA法でタンパク量を測ったところ、１wellあたり３０μgのタンパク量になっています。） 10cmdishでRIPAバッファーが50ulは少ない気がします。うちでは10cmdishでしたらRIPAバッファーは300から400ul入れてスクレイパーでゴシゴシ集めてチューブに入れます。手早く、あるいはオンアイスで冷たい状態でやります。 チューブに入れたサンプルは（常にオンアイス）ソニケーションするかシリンジに数回通します。遠心してペレット以外の上澄みをプロテインサンプルとして定量します。アプライするプロテイン量は（ターゲットプロテインにもよりますが）30ugは多い印象です。私は10から20ugをスタートで流しますね。 > ・SDS-PAGE⇒まっすぐバンドが進むときもあれば、スマイリング、逆スマイリングなどバンドが曲がってしまう時もある ランニングバッファーはできればキンキンに冷やしておいて下さい。できれば泳動のボックス自体を大きめの箱というかトレーにおいて氷を入れて、泳動ボックスを冷やしながら泳動するとキレイに一文字になります。（試しにランニングバッファーを少し温めて泳動してみると、見事にふにゃふにゃになりますよ。時間があればお試しあれ。）ただ多少曲がっていてもあんまり気にしないかな。 > ・転写➮セミドライで行っています。有色マーカーが転写されたことを確認し、終了しています。（メンブレン、ゲルの平衡化という概念を始めて知ったため、まだ平衡化は行ったことがありません。） ゲルからすべてのプロテインが転写されることはないと思います。（どなたか完全に転写されるようでしたら教えていただきたい。）ゲルとメンブレンの間にエアバブルが入らないようにすることと、なるべくゲルの形が四角になるように、転写後にバンドが曲がらないようにすることに気をつけています。 > ・ブロッキング➮市販のブロッキング溶液で室温1時間 > ・一次抗体➮TBSTで1:1000に希釈し、4度でO/N > ・二次抗体➮1:50000で室温1時間 > ・検出➮検出感度の高いものを使用（発光検出） うちでは一次抗体二次抗体はブロッキング溶液で希釈しています。二次抗体は1:10000から、1ul/10mlでやってます。計算もしやすいですし。 > 上記の試薬、方法で何度もWBを行っているのですが、メンブレン全体が白くなりマーカーしか検出できない、メンブレン全体が黒くなってしまうということが度々起こります。（3回に1回くらいはバンドが確認できますが、なんだかタンパク量の割に薄い気がしています。）（ＷＢの方法は変えていないのにも関わらず、結果がでたりでなかったりと安定しません） フィルムで検出していますか？それともスキャナー？メンブレンが真っ黒になるのであればTBSTでのウォッシュ時間を少し延ばしてください。

(無題) 削除/引用 No.12320-8 - 2024/05/18 (土) 21:31:01 - ゲンバ まず立ち上げの時点で 学部に正しいWBをやってて別の大学の院でWB構築任されたのか 上の者はWB経験あるのかそこからじゃない 経験者なら三分の一は成功してるんだから 少なくとも動物種とかの組み合わせでバンドが出ないのではない と判断できるけど それっぽいバンドが出たり真っ黒な時もある とかじゃ本当に正しい絵がとれてるかわかんない ポジコンに、2次抗体と確実にくっつく精製抗体でも用意して サンプルがうまくいかなくてもWBの流れ自体は間違いない という確認はしばらく要るのでは 泳動すら安定してないなら 泳動機器自体がおかしいのかもしれないし 成功はしてるけどバンドが薄いだけなら 抗体希釈比率（多分メーカー記載だとは思うけど） を濃くしてみて調節とか ぱっとみ二次抗体で50000倍って1uL/50mLだろうから 5000倍、1000倍で検証くらいならそこまで試薬も無駄にならん 膜に乗せれば4uL/4mLでも十分

(無題) 削除/引用 No.12320-7 - 2024/05/18 (土) 18:39:15 - signal 本当にご丁寧にありがとうございます。 とにかく、最初のサンプル調整の部分に問題がありそうなので、 もう一度タンパク定量から見直してみます。 主様が主に使っているタンパク質定量は、BCA法でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12320-6 - 2024/05/18 (土) 18:03:02 - おお > サンプルの泳動がマーカーに追い付かないというのは、サンプルバッファーの色素が遅れるということでしょうか？それならイオン性のものが多いと泳動は遅れます。無理矢理なLysisで細胞内のイオン性のタンパク以外の物がエンリッチしている可能性かあります。 補足しておくとサンプルの塩化ナトリウム濃度が高ければ泳動は遅れる傾向があります。今回はそういう塩濃度のはずはないですからリン脂質とかかもしれません。 > > > > > > ＞＞;転写後のゲルは、熱が強すぎる？のか丸まってしまいますが、これで大丈夫なのでしょうか。 > 泳動用、トランスファーようのバッファーなども確認してみてください、特に自作なら。 > > >

(無題) 削除/引用 No.12320-5 - 2024/05/18 (土) 17:50:56 - おお >[Re:4] signalさんは書きました : > ご返信ありがとうございます。 > > > ＞＞１wellはSDS-PAGEにアプライする1区間を指しています。10�pdishに50μlのRIPAバッファーは普通ではないとは感じていましたが、それでも検出できたときのバンドは不十分に感じました。 だから、Lysisからしてあべこべですから。500マイクロリッターでLysisするべきものを、50で抽出しようとしても、完全に抽出できないタンパクも出てくるから、検出したバンドの強さは当てになりません。それに泳動やトランスファーも上手くいってるか判断できない。ゲルを2枚用意して、1枚はトランスファー、もう一枚はゲルの状態でCBB染色すれば泳動のもんだいか、トランスファーの問題か検討がつく。 > > ＞＞マーカーが横に広がるときもありますし、サンプルの泳動がマーカーに追いつかないときもあります。 程度によりますけど、レーンが低分子側で広がっていく一つの理由は、隣のレーンに何もないかタンパク量が少ないから。なのでやはりタンパク抽出が完全でなくタンパク定量用の試薬に反応するタンパク以外のものがエンリッチしてしまってるか、定量用試薬の選択がまちがえているか。サンプルの泳動がマーカーに追い付かないというのは、サンプルバッファーの色素が遅れるということでしょうか？それならイオン性のものが多いと泳動は遅れます。無理矢理なLysisで細胞内のイオン性のタンパク以外の物がエンリッチしている可能性かあります。 > > > ＞＞;転写後のゲルは、熱が強すぎる？のか丸まってしまいますが、これで大丈夫なのでしょうか。 実際に熱は出てるでしょうか？ゲルは20％メタノールで若干縮みます。私は特別事がなければゲルは平衡化せずに転写しますが、その時転写中にゲルが縮まないようにある程度圧が掛かるようにしてます(たいていそうだとおもいます)。ですので転写を終えて中を取り出すと、その時点ででゲルが縮みます。

(無題) 削除/引用 No.12320-4 - 2024/05/18 (土) 16:10:10 - signal ご返信ありがとうございます。 ＞1 wellってプレート(6 well プレートとか)？10 cmDish？どっち？10 cmDishに50μlのRIPAバッファーはあり得ない数字だし。 10の6乗個ぐらいの細胞で数百マイクログラム取れるから10 cmDishなら1 ミリグラムとか取れてもおかしくない。のでLysisするのに500マイクロリッター前後のバッファーでいいくらいだ。 BSA法はBSAで検量線引いたという事だろうけど、そうするとLysatesのタンパクに結合したりして発色するケミカルがなにか分からない。とにかく細胞10cmdishに50μlのRIPAだとLysisが不完全でも相当高いタンパク濃度になっている筈なので、タンパク定量もうまく行ってない気がする。 ＞＞１wellはSDS-PAGEにアプライする1区間を指しています。10�pdishに50μlのRIPAバッファーは普通ではないとは感じていましたが、それでも検出できたときのバンドは不十分に感じました。 ＞なんのバンド？マーカーならゲルや泳動そうにバッファーに問題がある。スマイリングは色々な原因が考えられるが、サンプルなら質問のLysisの仕方を文面通りに捉えると乗せすぎと言ってもいいかもしれない。 ＞＞マーカーが横に広がるときもありますし、サンプルの泳動がマーカーに追いつかないときもあります。 ＞ゲルの平衡化はやらなくてもトランスファーできるので、それで問題がないならそれでいい。トランスファーがうまく行っているかは、トランスファー後のゲルをCBBで染めて見ると様子が掴めることもあるし、初心者ならそういう細かいところまで確認して欲しい。 メンブレンはニトロセルロースならトランスファーバッファーで完全に濡れてたらOK。PVDFはアルコールにつけて親水性を持たせてからバッファーに置換する。トランスファー後はメンブレンを染めて移り具合を確認して欲しい。ポンゾーとかファストグリーンがいいようです。それでトランスファーの問題か、検出段階での問題かわかる。 ＞＞;転写後のゲルは、熱が強すぎる？のか丸まってしまいますが、これで大丈夫なのでしょうか。 以前ポンソーで染めた時に薄くしかバンドが見えなかったため、タンパク濃度を現段階まであげたという経緯もあります。

(無題) 削除/引用 No.12320-2 - 2024/05/18 (土) 15:45:18 - おお > サンプル⇒細胞10cmdishに50μlのRIPAバッファー（BSA法でタンパク量を測ったところ、１wellあたり３０μgのタンパク量 1 wellってプレート(6 well プレートとか)？10 cmDish？どっち？10 cmDishに50μlのRIPAバッファーはあり得ない数字だし。 10の6乗個ぐらいの細胞で数百マイクログラム取れるから10 cmDishなら1 ミリグラムとか取れてもおかしくない。のでLysisするのに500マイクロリッター前後のバッファーでいいくらいだ。 BSA法はBSAで検量線引いたという事だろうけど、そうするとLysatesのタンパクに結合したりして発色するケミカルがなにか分からない。とにかく細胞10cmdishに50μlのRIPAだとLysisが不完全でも相当高いタンパク濃度になっている筈なので、タンパク定量もうまく行ってない気がする。 > まっすぐバンドが進むときもあれば、スマイリング、逆スマイリングなど なんのバンド？マーカーならゲルや泳動そうにバッファーに問題がある。スマイリングは色々な原因が考えられるが、サンプルなら質問のLysisの仕方を文面通りに捉えると乗せすぎと言ってもいいかもしれない。 > ・転写➮セミドライで行っています。有色マーカーが転写されたことを確認し、終了しています。（メンブレン、ゲルの平衡化という概念を始めて知ったため ゲルの平衡化はやらなくてもトランスファーできるので、それで問題がないならそれでいい。トランスファーがうまく行っているかは、トランスファー後のゲルをCBBで染めて見ると様子が掴めることもあるし、初心者ならそういう細かいところまで確認して欲しい。 メンブレンはニトロセルロースならトランスファーバッファーで完全に濡れてたらOK。PVDFはアルコールにつけて親水性を持たせてからバッファーに置換する。トランスファー後はメンブレンを染めて移り具合を確認して欲しい。ポンゾーとかファストグリーンがいいようです。それでトランスファーの問題か、検出段階での問題かわかる。 > ・一次抗体➮TBSTで1:1000に希釈し、 > ・二次抗体➮1:50000で室温1時間 商品の説明の抗体量は一応目安。他に問題がなく、バンドが弱すぎるなら濃度を上げて最適な条件を探る事も必要になることもある。バンドが強すぎる時も同様。 ググれば10cmDishでどれ位のスケールでとか大体検討がつくと思うけど、、例えば、 https://www.bio-rad-antibodies.com/western-blot-protocol-cell-lysis-mammalian-cells.html?JSESSIONID_STERLING=A5A657247310114B813BB9C4F59EE123.ecommerce1&&evCntryLang=US-enthirdPartyCookieEnabled=true Adherent Cells …. Add appropriate volume ice cold lysis buffer (with fresh protease inhibitors), to the flask, approximately 1ml for a 100 mm tissue culture dish. (Alternatively, cells can be removed from the flask with Trypsin-EDTA and then prepared using the suspension cell instructions below). Incubate for 20 minutes on ice, and then scrape cells from the surface using a rubber spatula. Transfer to a microfuge tube and clarify the lysate by spinning for 10 minutes at 12,000 rPM, at 4°C. Transfer supernatant to a fresh tube and store on ice or frozen at -20°C or -80°C. 因みにTrypsin-EDTAを使う方法はお勧めしない。

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