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(無題) 削除/引用 No.12317-21 - 2024/05/19 (日) 17:45:50 - G25 こちらの説明書のReagent Compatibility Table が詳しかったですね。 DOCは結合を妨げるのでM2には使うなと明記されています。 https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/236/831/a2220bul-mk.pdf

(無題) 削除/引用 No.12317-20 - 2024/05/19 (日) 17:34:20 - G25 >また、はっきりとM2にはDOCは使用できないと書いているものもありました(ネットで拾った羊土社の本の抜粋) リンクをペーストするの忘れてた https://www.yodosha.co.jp/bookdata/9784758101752/9784758101752_03.pdf

(無題) 削除/引用 No.12317-19 - 2024/05/19 (日) 12:08:26 - G25 前から指摘されている界面活性剤による抗体のアフィニティ低下の可能性について、 anti-FLAG Mabの株の違いで性質が異なるかも知れないところですが、 共存が許容される界面活性剤の種類と濃度は説明書などで確認していますか？ SDSみたいなイオン系の界面活性剤は論外でしょうけど、 お使いになっている1% DOCはやはりかなりあやしい。 M2の能書きによるとDOCは言及されていないけど、性質の近いジギトニンは0.2%までとあります。 https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/231/635/m8823bul-mk.pdf また、はっきりとM2にはDOCは使用できないと書いているものもありました(ネットで拾った羊土社の本の抜粋) 別の話で、 whole lysateのWBでは検出できるけど抗体ビーズには結合しないということなので、 変性状態でなければエピトープが抗体に認識されないということが考えられます。 SDS-PAGEからのWBでは検出できるけど、抗体染色やIPで非変性状態だと検出できないというケースはしばしばあります。変性しないとエピトープが露出しないタンパク質なんかですね。 あるいは膜タンパクということなので、lysate中にはミセルに埋め込まれた状態だと思いますが、その状態だと抗体と反応しにくいとか。 かと言ってcoIPが目的なので変性してIPというわけにもいきませんしね。 今のコンストラクトに固執せず、タグの位置(N末、C末)を変えるとかタグの種類を変えるてみるのが解決の道かも。

(無題) 削除/引用 No.12317-17 - 2024/05/19 (日) 08:59:52 - おお >[Re:16] 心配性さんは書きました : > >[Re:3] おおさんは書きました : > 構造的に内部に位置していますので、おおさんのおっしゃる通りマイルドなデタージェントで解決するわけではなさそうです。 なんでそれがわかるのかよくわかりませんが、、、蛋白複合体の構造がわかっているとか？ちなみに膜に埋もれていてもデタージェントが入っているの膜はないものと思えます。まあそれでも構造的問題であろうという可能性は指摘できますけど、一つの推測として。 > また、whole cell lysateのWBでflag抗体をしたところ、このサンプルは15-20kDaにバンドが濃く出てきました　（上手く行ったサンプルは50kDaあたりに一番濃く出ました）。これらが何か示していることや上手くいかなかった原因につながってるでしょうか。。。 > IPで使ったのはどっちなんだろうか、、、 そもそもあなたの蛋白のサイズや特徴がわかりませんけど、、、分解の可能性は考えられます。 バッファー組成を見返すと、プロテアーゼを阻害するのはleupeptinだけなので、これではちょっと心もとない気がします。大抵は複数のインビビターをミックスするとおもいます。 AEBSF or PMSF Aprotinin Leupeptin Pepstatin E64 TLCK TPCK など。 それぞれ買ってMixするのは面倒ではあるので。Mixしたカクテルが売ってますそういうのを使えばいいのではと思います。ナカライさんも出しているのではとおもいますが。 また分解の可能性以外も蛋白によっては考えられます、プロテインテックさんがまとめていたと思いますが、、、主な原因はプロセッシングによるものです。

(無題) 削除/引用 No.12317-16 - 2024/05/18 (土) 23:25:07 - 心配性 >[Re:3] おおさんは書きました : > 他の蛋白でIPしてワークしているということは、その目的の蛋白のFLAGは抗体がアクセスしにくい状態になっていると思います（構造的に内部に位置しているとか、蛋白コンプレックスの中に隠れているとか）。そうするとマイルドなデタージェントで解決するのだろうかと思えます。あえてやれることとしてはそのRIPA bufferの組成にさらに0.1％のSDSを加えるか、塩濃度を若干高くする（〜３００mM）ことでしょうか。 > 構造的に内部に位置していますので、おおさんのおっしゃる通りマイルドなデタージェントで解決するわけではなさそうです。 また、whole cell lysateのWBでflag抗体をしたところ、このサンプルは15-20kDaにバンドが濃く出てきました　（上手く行ったサンプルは50kDaあたりに一番濃く出ました）。これらが何か示していることや上手くいかなかった原因につながってるでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.12317-15 - 2024/05/18 (土) 22:40:08 - 心配性 >[Re:12] G25さんは書きました : > >>WBでは出たanti-flagのバンドがco-ip後は見られませんでした。 > > >簡潔に言うと、 > >RIPAのライセートを直接WBしたら検出できるFLAG-融合タンパク質が、anti-FLAGでIPしたら検出できないということですね。 > > coIPと書いてあるのでミスリードされるかもですが > coIP実験をやったときのトラブルにはちがいないけど、FLAG-融合タンパク質のanti-FLAG AbのIPができてないってことですよね。 > coIPでタンパク質-タンパク質複合体が保持できないという問題じゃなくて。 > > > > この通りです。問題点がありすぎてどこからチェックすればいいかわからなくなり、質問で混乱させてしまいましたが、whole cell lysateを抽出→一部をWB、残りをanti-flag magnetic beadsと一晩incubateさせています。しかし、WBではanti-flagでバンドが見えるのに対してmagnetic beads後ではanti-flagでバンドがなくなります。

(無題) 削除/引用 No.12317-14 - 2024/05/18 (土) 22:35:42 - 心配性 >[Re:13] ねずみさんは書きました : > >[Re:12] G25さんは書きました : > > coIPと書いてあるのでミスリードされるかもですが > > coIP実験をやったときのトラブルにはちがいないけど、FLAG-融合タンパク質のanti-FLAG AbのIPができてないってことですよね。 > > coIPでタンパク質-タンパク質複合体が保持できないという問題じゃなくて。 > > 私も、Co-IPの問題ではなくIPの問題と受け取りました。で、細胞質タンパクに対しては問題ないのでanti-FLAG beadsはちゃんとワークしているということかと（FLAG付き細胞質タンパクを発現させてのIPはできたということ？）。そうであればタンパクータンパクのインタラクションとか抗体の反応性とか、Lysis bufferの問題ではないとに思ったのですが。。抽出の問題ではない、との回答がありましたので、もう少し質問者さんからの情報がほしいところです。 はい！FLAG付き細胞質タンパクを発現させてのIPはできていましたが (AntiFlagでバンドが観察できる)、細胞膜内タンパク質のサンプルではAntiFlagでバンドが見られませんでした。結合相手のバンドが見られない以前の問題なので、lysis bufferで結合ー結合が崩れたという問題ではない気がしてきました。。。

(無題) 削除/引用 No.12317-13 - 2024/05/16 (木) 17:10:07 - ねずみ >[Re:12] G25さんは書きました : > coIPと書いてあるのでミスリードされるかもですが > coIP実験をやったときのトラブルにはちがいないけど、FLAG-融合タンパク質のanti-FLAG AbのIPができてないってことですよね。 > coIPでタンパク質-タンパク質複合体が保持できないという問題じゃなくて。 私も、Co-IPの問題ではなくIPの問題と受け取りました。で、細胞質タンパクに対しては問題ないのでanti-FLAG beadsはちゃんとワークしているということかと（FLAG付き細胞質タンパクを発現させてのIPはできたということ？）。そうであればタンパクータンパクのインタラクションとか抗体の反応性とか、Lysis bufferの問題ではないとに思ったのですが。。抽出の問題ではない、との回答がありましたので、もう少し質問者さんからの情報がほしいところです。

(無題) 削除/引用 No.12317-12 - 2024/05/16 (木) 12:28:21 - G25 >>WBでは出たanti-flagのバンドがco-ip後は見られませんでした。 >簡潔に言うと、 >RIPAのライセートを直接WBしたら検出できるFLAG-融合タンパク質が、anti-FLAGでIPしたら検出できないということですね。 coIPと書いてあるのでミスリードされるかもですが coIP実験をやったときのトラブルにはちがいないけど、FLAG-融合タンパク質のanti-FLAG AbのIPができてないってことですよね。 coIPでタンパク質-タンパク質複合体が保持できないという問題じゃなくて。

(無題) 削除/引用 No.12317-11 - 2024/05/16 (木) 10:49:05 - mp > > RIPAのSDSは他のデタージェント（NP-40やTriton X-100など）のミセルに取り込まれているため変性作用がかなり低減されていると言われてます。もちろんSDSを入れないのと入れたのを比べると、入れたほうが強い界面活性効果が得られるので物によってはいれると複合体が見れないということもあります。 なるほどそうなんですね。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.12317-10 - 2024/05/16 (木) 10:38:22 - おお >[Re:8] mpさんは書きました : > >[Re:4] おおさんは書きました : > > >[Re:2] mpさんは書きました : > > > 共沈実験の時は普通sdsとdeoxycholateはいれないです。 > > > > そんなことはないと思うが。。 > > う〜んそうかなあ？ > よっぽど強い結合でない限り、0.1％SDSでは複合体は壊れてしまうと思うけど。ただトピ主さんのケースは強制発現系なので、もしかしたら大丈夫かもしれない。 > RIPAのSDSは他のデタージェント（NP-40やTriton X-100など）のミセルに取り込まれているため変性作用がかなり低減されていると言われてます。もちろんSDSを入れないのと入れたのを比べると、入れたほうが強い界面活性効果が得られるので物によってはいれると複合体が見れないということもあります。

(無題) 削除/引用 No.12317-9 - 2024/05/16 (木) 10:32:10 - G25 >WBでは出たanti-flagのバンドがco-ip後は見られませんでした。 簡潔に言うと、 RIPAのライセートを直接WBしたら検出できるFLAG-融合タンパク質が、anti-FLAGでIPしたら検出できないということですね。 抗原-抗体の結合が弱いということで、まず疑うのは界面活性剤の種類と濃度ですね。 たとえば、こちらのIPを目的としたRIPA バッファ製品の界面活性剤はNP-40のみです。 https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/immunoprecipitation/ このようなIP用をうたった製品を使うとか、組成を参考にするとかしてみては。 お使いのRIPAバッファの組成をみると、フォスファターゼの影響を受けるタンパク質なのでしょうか。 ベーシックな組成とはだいぶ違いますね。

(無題) 削除/引用 No.12317-8 - 2024/05/16 (木) 10:02:00 - mp >[Re:4] おおさんは書きました : > >[Re:2] mpさんは書きました : > > 共沈実験の時は普通sdsとdeoxycholateはいれないです。 > > そんなことはないと思うが。。 う〜んそうかなあ？ よっぽど強い結合でない限り、0.1％SDSでは複合体は壊れてしまうと思うけど。ただトピ主さんのケースは強制発現系なので、もしかしたら大丈夫かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12317-7 - 2024/05/16 (木) 09:38:32 - おお >[Re:5] ゆさんは書きました : > 0.5~1%SDSを含む少量の適当なbufferで細胞を可溶化したのち、 免疫共沈降実験と書かれているので、変性作用のつよいSDS単独では大抵の蛋白は複合体を維持できず、結合すると考えている蛋白は共沈しないのがたいていだと思いますが、、、 この方法を使うのなら先にクロスリンク処理をしてコバレントに結合させてSDSで抽出したほうが良さそうですが。 ーーー 抽出がうまく行ってない可能性を指摘している回答が見受けられますが、IPのためにLysateをRIPAで作り、そのLysateをInputとしてCo-IPフラクションと一緒に流しているのではないかと思うのですが、ならば抽出はできているということですよね。

(無題) 削除/引用 No.12317-6 - 2024/05/16 (木) 08:39:11 - ねずみ WBのときとCo-IPのときと、サンプル処理は同じように行ったのですか？ 細胞質のタンパクはちゃんと落ちるのに細胞膜に埋まったタンパクが落ちてこない、というのならFlagタグ付きの膜タンパク質がちゃんと抽出できていないのかな、と思いました。 WBでも同じRIPAを使っているのであればちょっとわからないです。 Flagタンパクとコンプレックスを作るタンパクがFlagをマスクしてしまうとか？

(無題) 削除/引用 No.12317-5 - 2024/05/16 (木) 08:21:01 - ゆ WBでは検出できたとありますが、その際に使用したタンパク質抽出用bufferはIPの時と同じものでしょうか。SDS-sample bufferを除いて、可溶化の段階で、うまく抽出できないタンパク質は割とあります。特に複数回膜貫通するような膜タンパク質などではbuffer組成によっては可溶化の段階でうまくいっていないこともしばしばあります。もともと目指すものがほとんど含まれていない試料に抗体beadsを入れて、IPできないと悩んでいる人が時々います。 0.5~1%SDSを含む少量の適当なbufferで細胞を可溶化したのち、シリンジまたは超音波（注：超音波の場合はやりすぎないこと。アミノ側鎖の酸化や高分子量タンパク質でのペプチドの切断が起きることがある）でDNAを剪断して、遠心して不溶物を除きます（通常はほとんど何もないはずですが。）その後、おおよその体積比でその10~20倍容量のRIPAbuffer(SDSは含まない）もしくは0.5~1%Triton X (またはNP40)を含むbufferで希釈してIP用のサンプルとします。 CHAPSは植物などのある種の膜タンパク質はよく溶かすようですが、それ自体はそれほど強力な可溶化剤ではないです。 その膜タンパク質がもしLipid laftに局在しているような場合は、一般的に汎用されるTriton XやNP40では可溶化できません。もし該当するようならばLipd laft用の可溶化剤が市販されているので、論文なども含めて確認ください。

(無題) 削除/引用 No.12317-4 - 2024/05/16 (木) 06:44:35 - おお >[Re:2] mpさんは書きました : > 共沈実験の時は普通sdsとdeoxycholateはいれないです。 そんなことはないと思うが。。。

(無題) 削除/引用 No.12317-3 - 2024/05/16 (木) 06:41:21 - おお 他の蛋白でIPしてワークしているということは、その目的の蛋白のFLAGは抗体がアクセスしにくい状態になっていると思います（構造的に内部に位置しているとか、蛋白コンプレックスの中に隠れているとか）。そうするとマイルドなデタージェントで解決するのだろうかと思えます。あえてやれることとしてはそのRIPA bufferの組成にさらに0.1％のSDSを加えるか、塩濃度を若干高くする（〜３００mM）ことでしょうか。 もちろんCHAPSを使ってみてもいいかもしれません。その場合はRIPAのsodium deoxycholateの代わりに使うか、CHAPS単独か。RIPAにさらにCHAPSを加える組成は見たことがありません（だめというつもりはありません）。あるいは1% sodium deoxycholate単独とかでも可能性はなきにしもあらずです。こういうのは使ってみないとわからないので。 HEPESがどうこうというのはHEPESはpH緩衝剤として使うのでデタージェントや可溶化にはほとんど寄与しませんのでHEPESであろうがTRISであろうがどちらでもいいでしょう（特殊な例でどっちがいいという話がまったくないわけではありませんけど）。 しかしながらこういう条件を探る試みは必ずしもうまく行くものでもないので、その膜タンパクに結合していると考えている蛋白を抗体で沈降して、WBでFLAGを検出するほうがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12317-2 - 2024/05/16 (木) 05:45:46 - mp 共沈実験の時は普通sdsとdeoxycholateはいれないです。

免疫沈降 削除/引用 No.12317-1 - 2024/05/16 (木) 05:04:07 - 心配性 似たようなトピックはあったのですが、答えが見つからなかったので新しく質問させてください。 免疫共沈降実験を行なっているのですが、適切なlysis bufferが何かで悩んでいます。cell signallingのRIPA bufferを使ったのですが、WBでは出たanti-flagのバンドがco-ip後は見られませんでした。 沈降させたいものは、細胞膜内に埋まっているもので、HEK293T細胞にFLAGタグ付きのものを過剰発現させ、anti-FLAG　magnetic beadsで沈降させています。 WBで見たものが見えないので、beadsのやり方に問題があるかと思いましたが、同時に行った細胞質にあるタンパク質のサンプルのではきちんと現れたのでbeadsには問題がないかと思われます。 細胞膜内に局在するタンパク質にはCHAPSが良いと調べていて辿り着いたのですが、HEPESに入れるのが良いのか、今持っている RIPA bufferに加えても良いのかもわからず、教えていただけたらと思います。また、他に何か問題点や見落としているものがあったら教えていただきたいです。 ちなみに使ったRIPA bufferの中身はこのようになっています。 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA 1 mM EGTA 1% NP-40 1% sodium deoxycholate 2.5 mM sodium pyrophosphate 1 mM b-glycerophosphate 1 mM Na3VO4 1 µg/ml leupeptin.

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