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(無題) 削除/引用 No.12311-11 - 2024/05/14 (火) 18:33:56 - おお 最初に94度とかで数分の変性とホットスタートなら活性化の過程があるので、大流でまかなえそうだが。気になるならそこに色素を入れて水とかをそっと重層して、最初の94度の過程でストップして混ざり具合を確認するとか、混ざるのにひつようなじかんを割り出すとかできなくもない。

(無題) 削除/引用 No.12311-10 - 2024/05/14 (火) 18:11:30 - noname PCR Mixをvortexすることについて、qPCRのミックスは結構頑丈に作られているようで、vortexしても反応的には問題ないです。 何なら国の遺伝子組み換え食品の検査法には、マスターミックスを調製する時は3秒程度、ミキサーで混合してからスピンダウンせよとなっています。 検査という観点からいくと、よく混ぜるということを重視するのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12311-9 - 2024/05/14 (火) 18:01:52 - あの ウェル単位では混ぜませんが、プレートごとに水平にゆすって、スピンダウンします。 これと、低速のプレートシェイカーでゆすったときと比較では、体感ですが、違いはないです。

(無題) 削除/引用 No.12311-8 - 2024/05/14 (火) 17:56:12 - 774R タッピングしてスピンダウン

(無題) 削除/引用 No.12311-7 - 2024/05/14 (火) 17:16:54 - T 混ぜません。まさに >熱による対流が生じ 充分に混ざってPCRはかかるから、と教わりました。もしバンドが出なかったら別の要因だ、とまで。実際、20年超PCRやってますが、混ぜたこと無いです。多分98%超の確率でバンドはキッチリ出てますが、バンドが出なかった時の問題はやはり別の要因（プライマー間違ってた、とか）でした。クローニングで難しいPCRもやってきましたが、やはり混ぜたことないです。 杏里さん名指しで申し訳ないのですが、私は逆に、酵素が入った溶液をVortexでよく混ぜろというラボとは、正直ちょっと怖くてコラボできないなあ、と思います。これ他の方々はどう思われますでしょうか？（実際には問題無くバンドが出ることの方が多いだろうことは承知してます）。

(無題) 削除/引用 No.12311-6 - 2024/05/14 (火) 17:03:14 - qq 鋳型とプライマー＋DWを先に入れて、9ulの酵素液を後で入れちゃだめなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12311-5 - 2024/05/14 (火) 16:53:08 - 杏里 Vortexで良く混ぜる必要があります。その後スピンダウン。 混和が不十分だと定量値のばらつきの原因になります。 とにかく、よーく混ぜましょう。 以前、核酸は不安定だからPCRチューブは混ぜてはダメ、と試しもせず 言う人が居て、そのラボとは共研できない、と見限ったことがありました。

(無題) 削除/引用 No.12311-4 - 2024/05/14 (火) 16:38:17 - AA qPCRではなくて普通の遺伝子型判定のPCRなどがメインですが、鋳型以外を含んだマスターミックスを分注後、各サンプルのDNAを入れる場合は混ぜません。 とにかくバンドが出ればいい程度のPCRだからか、それでも特に問題なくPCR出来ています。 Cre+flox+ROSAレポーター+イメージング用のセンサー、とかで1サンプルが3遺伝子も4遺伝子も持っていると日々のgenotypingだけでも本数が莫大で、なるべく楽できるところは楽するようにしています

(無題) 削除/引用 No.12311-3 - 2024/05/14 (火) 16:36:20 - かかか 私は混ぜませんが（混和はしない）、遠心は必ずします。 液滴が混ざるようにするため。

(無題) 削除/引用 No.12311-2 - 2024/05/14 (火) 16:13:20 - が 場合によりますが、10ulのqPCR反応を仕込む際に、1ulのDNAサンプルを9ulのPCR溶液にいれる場合、混ぜません。以前、混ぜる場合と、混ぜない場合の2種類を作って、qPCRのカーブの立ち上がりを見たことがあるのですが、全く同じでした。高温処理で、サンプル内の対流が混ぜてくれるのでは、と思っています。

混ぜますか？？ 削除/引用 No.12311-1 - 2024/05/14 (火) 16:10:45 - PCR PCR の際、テンプレート以外の試薬を混ぜたプレミックスをPCR tube に分注し、最後にテンプレートだけ入れていくという作業をやると思います。この時、テンプレートを入れた後に皆さんはピペッティングしてますか？自分は何百という数のサンプルを扱っているので失敗が怖いため毎回必ずピペッティングしていますが、やらなくて良いならめちゃくちゃ楽になります。PCR では熱による対流が生じ、混ぜなくても普通に反応が進むという噂を聞きました。

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