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(無題) 削除/引用 No.12311-32 - 2024/05/22 (水) 09:06:23 - PCR 出題者です。 皆様ここまでありがとうございます。 サンプル作成後ピペッティング無し、タッピング→遠心でフラッシュ ではばっちりうまくいくことを確認できました。 タッピング、遠心さえ無いバージョンは・・・怖くて試していません。タッピング、遠心は全然手間じゃないので自分的にはこれで十分です。

(無題) 削除/引用 No.12311-31 - 2024/05/21 (火) 14:17:24 - おお いやいやそうでなくって、これはものの見方の違いですれ違いがあっただけですよ。Tさんもたくさん論文読んでるかもしれないじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.12311-30 - 2024/05/21 (火) 13:04:58 - おお たくさん論文を読んでるおおさんのこと、バカにすんじゃねえぞ… http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=12291

(無題) 削除/引用 No.12311-29 - 2024/05/21 (火) 09:48:43 - T >すいません。これは私の頭の中でどう整理をしようか、色々考えられることを列挙して、一般論としてどう捉えるのがいいのか、そういうときにどうアプローチしていけばいいのか自分の中で模索しているのです。 それは自分のノートにでも書いて下さい。私はおおさんの書き込みを読んで非常に不愉快になりました。 1.2倍などという微差を主張するなんてこいつは多分何かおかしいんだろう、を心の中で思うのは各人の勝手です。かつての自分も同じように思ってましたから。しかし、それを相手のいるネット掲示板に書くのであれば、きちんとした理論の下で書くべきでしょう。なんとなくこいつのやってることおかしくね？（そういう意図では無かったと言われるかもしれませんが、そう捉える人がいても不思議の無い書き込みですよね）なんて吹聴されて気分の良い人はいないです。 こちらは、私もこんな微差は怪しいと思っていたが、自分がやっても他人（テクニシャン）がやっても再現性良く結果が取れたので考えを改めたと書いているのに、貴方の結果は20回に1回の紛れかも知れません、と言って来るのは一般論としてどう捉えるとかからはかけ離れた物言いではないですか？ 理論に見せかけてその実なんの理論にもなってないことを書かれるのは非常に迷惑です。 >インターナルコントロールもぶれているかもしれません って、そう考えられる理由はなんですか？微差だから？おかしな話でしょう。ちっとも理論的じゃない。 つらつら書いてみただけなんです、って、いい歳した大人のやるこっちゃないでしょう。外に向かって書くのと、自分の内に向けて書くのは明確に違う事くらいわかっていて当然ではないですか？

(無題) 削除/引用 No.12311-28 - 2024/05/21 (火) 09:22:08 - おお >[Re:27] Tさんは書きました : > >[Re:26] おおさんは書きました : > > で、話をぶり返すようなのですが、やはり1.2倍は引っかかります。それは細胞内でほんとに1.2倍増えているかという点でクリアにする材料がないからです。インターナルコントロールもぶれているかもしれません（なるべくぶれないものを使っているだけです）。細胞内のmRNA量が全体的に減っていれば細胞内でのターゲットのmRNAの濃度は低くなってしまいます。 > > > > 細胞内のRNA量についてはInformaticsの分野でも補正の方法が模索されていて、それを下にRNAseqのデーターを解析すると従来の方法で増えていると思われるものが減っていたりと結構解釈に影響を与える結果が出たりしているようです。 > > なぜかぐちぐち言われてるのは正直気分が悪いです。そういう物言いをするのであれば、全ての人のqPCRで出た結果は信用ならないことになるでしょう。いくらでもイチャモン付けられますよね？ > > 私がなにをコントロールに使ったかも知らないのに、あなたのコントロールはブレてるかもしれませんだからあなたのqPCRで出た結果は嘘かも、と言いたいんですかね？ すいません。これは私の頭の中でどう整理をしようか、色々考えられることを列挙して、一般論としてどう捉えるのがいいのか、そういうときにどうアプローチしていけばいいのか自分の中で模索しているのです。察するにTさんの場合は発現抑制（KD?）や他の実験で裏を取っているようなのでそれはうまく仕上げたと思っています。

(無題) 削除/引用 No.12311-27 - 2024/05/21 (火) 07:45:18 - T >[Re:26] おおさんは書きました : > で、話をぶり返すようなのですが、やはり1.2倍は引っかかります。それは細胞内でほんとに1.2倍増えているかという点でクリアにする材料がないからです。インターナルコントロールもぶれているかもしれません（なるべくぶれないものを使っているだけです）。細胞内のmRNA量が全体的に減っていれば細胞内でのターゲットのmRNAの濃度は低くなってしまいます。 > > 細胞内のRNA量についてはInformaticsの分野でも補正の方法が模索されていて、それを下にRNAseqのデーターを解析すると従来の方法で増えていると思われるものが減っていたりと結構解釈に影響を与える結果が出たりしているようです。 なぜかぐちぐち言われてるのは正直気分が悪いです。そういう物言いをするのであれば、全ての人のqPCRで出た結果は信用ならないことになるでしょう。いくらでもイチャモン付けられますよね？ 私がなにをコントロールに使ったかも知らないのに、あなたのコントロールはブレてるかもしれませんだからあなたのqPCRで出た結果は嘘かも、と言いたいんですかね？ 私の対象としているRNAは、私のやった実験条件では1.2倍程度の上昇が再現よく（それこそもうトータルでは100well分以上を少なくともduplicateで試してます）複数人の手で得られました。これが全てです。コントロールを変えれば上昇率が変わったり、あるいは減少に変わる可能性を否定はしませんが、取り敢えず私が使ったコントロール(Hprtです。ターゲットのCt値と近いCt値なので）は特に変動が見られなかったことは述べておきます。 >細胞内でほんとに1.2倍増えているかという点でクリアにする材料がないからです。 じゃあ、仮に貴方のqPCRで3倍の差が出た時、論文にする場合はそれをクリアにする材料を毎回提示してるんですかね？qPCRだけじゃ怪しいからノーザンも試しました、とかやってるんですか？それとも3倍だから別にいらないでしょう、とでも？じゃあ2.5倍なら？1.8倍なら？その「Informaticsの分野で」模索された補正では、従来の方法でもこれ位の差なら大丈夫、なんて閾値でもあるんですか？そもそもそちらの補正の仕方の方が正しいと担保できる材料はあるんですか？ 明確な理論の下に疑問を呈されるなら喜んで対応しますが、これじゃ理論に見せかけた屁理屈でしょう。よく読めば、理論的なことは一つも言ってないですよね？勘弁して下さいよ。

(無題) 削除/引用 No.12311-26 - 2024/05/21 (火) 04:20:59 - おお >[Re:25] Tさんは書きました : > > もちろんいろいろなデーターを突き合わせて逆の主張をすることがないとまでは言いません。 > > 逆の主張になりました。その20%程度の上昇で下流のシグナリング、表現型に影響が出て、かつ20%程度の上昇を止めることでそれらシグナリング、表現型への影響を止めることが出来たからです。 > 勿論、このような小さい数字が本当に生物学的に意味があるのか？というのは理解できます。私も同じこと思ってました。昔、自分がやってる範囲ではこういう微差だが下流に与える影響は大きい、という話をしてた先生がその後に捏造が大々的にバレた話がありました。当時は、適当言いやがってと思ってましたが、もしかしたら嘘じゃなかったのかもと思い直すことになりましたよ。 状況説明ありがとうございました。それでほぼ納得がいきました。 実は生化学的にみると1.2倍は大きい可能性があります。生体内の酵素反応はアロステリックな作用などを受けているものが少なくはないと思っています。そのためある程度の基質濃度（基質が蛋白であることもある）に達すると反応がONになることもあるかと。 > > 私が一回だけやった結果、それが20回に1回に当たったのでは？と言ってんですかね？こんな小さい差なんだから、当然何度も何度も繰り返して確認してますよ。私、再現性良く結果が取れたから考えを改めたって書きましたがね。 この件に関しては失礼いたしました。 で、話をぶり返すようなのですが、やはり1.2倍は引っかかります。それは細胞内でほんとに1.2倍増えているかという点でクリアにする材料がないからです。インターナルコントロールもぶれているかもしれません（なるべくぶれないものを使っているだけです）。細胞内のmRNA量が全体的に減っていれば細胞内でのターゲットのmRNAの濃度は低くなってしまいます。 細胞内のRNA量についてはInformaticsの分野でも補正の方法が模索されていて、それを下にRNAseqのデーターを解析すると従来の方法で増えていると思われるものが減っていたりと結構解釈に影響を与える結果が出たりしているようです。 うーん。でもやはりサポートするデーター次第なのかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.12311-25 - 2024/05/17 (金) 18:04:16 - T > ちなみに0.3で20%超、0.2で20％弱で0.2で有意差がでたということですが、私の感覚（実験している環境）では統計的に有意差がついたが生物学的意義を主張するだろうかと言うのが感想です。細胞内の発現量の違いとかならそう思えます。有意差がついたが発現量の差はかなり小さく、生物学的に有意とは言えないという記述をするかもしれないです。もちろんいろいろなデーターを突き合わせて逆の主張をすることがないとまでは言いません。 逆の主張になりました。その20%程度の上昇で下流のシグナリング、表現型に影響が出て、かつ20%程度の上昇を止めることでそれらシグナリング、表現型への影響を止めることが出来たからです。 勿論、このような小さい数字が本当に生物学的に意味があるのか？というのは理解できます。私も同じこと思ってました。昔、自分がやってる範囲ではこういう微差だが下流に与える影響は大きい、という話をしてた先生がその後に捏造が大々的にバレた話がありました。当時は、適当言いやがってと思ってましたが、もしかしたら嘘じゃなかったのかもと思い直すことになりましたよ。 > ちなみにnが３とか４であればたまたまきれいに揃った数字が出ることもあります。有意水準を５％とすると２０回に１回は差がないのに差があると結論付けられる可能性があると大雑把に言えます。 私が一回だけやった結果、それが20回に1回に当たったのでは？と言ってんですかね？こんな小さい差なんだから、当然何度も何度も繰り返して確認してますよ。私、再現性良く結果が取れたから考えを改めたって書きましたがね。

(無題) 削除/引用 No.12311-24 - 2024/05/17 (金) 17:46:22 - あ 結局、自分の経験に基づくことなので、９６ウエルプレートにデュプリケートでテンプレートを入れて、一方は混ぜもう一方は混ぜずに反応させて電気泳動してみれば良いと思いますよ。それで自分で判断すればいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12311-23 - 2024/05/17 (金) 12:57:22 - PCR 出題者です。 皆様、ここまでのところたいへんありがとうございます。 私はqPCRではなく、普通のPCR後にフラグメントを生成してシークエンスするような解析を行なっています。ですので、増幅されるフラグメントの量が２−３倍違っても全く問題ありません。なんとなくピペッティング不要な気がしてきましたが（うれしい）、参考になるので、それ以外の実験系に関する議論も引き続きお願いいたします。ありがたく拝見いたします。

(無題) 削除/引用 No.12311-22 - 2024/05/17 (金) 02:17:34 - おお 混ぜたとき、そうでないときでCt値のがどれだけブレてそれが許容範囲だとかそうでないとか、それぞれの実験で目指すところが違いますから、そういった議論は不毛だと思います。それぞれの実験者が自身の実験においてこれぐらいは許容範囲だとかそうでないとか決めればいいだけの話ではないでしょうか。 ちなみに0.3で20%超、0.2で20％弱で0.2で有意差がでたということですが、私の感覚（実験している環境）では統計的に有意差がついたが生物学的意義を主張するだろうかと言うのが感想です。細胞内の発現量の違いとかならそう思えます。有意差がついたが発現量の差はかなり小さく、生物学的に有意とは言えないという記述をするかもしれないです。もちろんいろいろなデーターを突き合わせて逆の主張をすることがないとまでは言いません。 ちなみにnが３とか４であればたまたまきれいに揃った数字が出ることもあります。有意水準を５％とすると２０回に１回は差がないのに差があると結論付けられる可能性があると大雑把に言えます。

(無題) 削除/引用 No.12311-21 - 2024/05/16 (木) 21:57:39 - たろう > え、Ct値で0.3違ったら結構な違いじゃないですか？ おや、そうですか。 自分の実験系では上下の差がこれぐらいです。 遠心無しだと0.6ぐらい違いました。

(無題) 削除/引用 No.12311-20 - 2024/05/15 (水) 21:49:24 - T >[Re:18] たろうさんは書きました : > ボルテックスミキサーで混ぜる > タッピングで混ぜる > 混ぜない > これら3種類の操作によってCt値は0.3も違いません。 > > 遠心はしないとCt値がばらつきます。 > > 論より証拠で、自分の試薬・手順・機器で試してみるべきです。 え、Ct値で0.3違ったら結構な違いじゃないですか？ 遠心ありなしでのばらつきはどれ位になりました？私が試した時はこれが上下で0,4弱あって、こりゃいかんとなったんですけど、多分0.2でも問題視しましたよ? Ct値の違いが0.4なら30%超、0.3で20%超、0.2で20％弱位の違いってことになるのかな。気にしない方は気にしないのだろうけど、私は20%の違いだったらやっぱり気になりますね。 もっとも、PCRで2倍(100%）以下の違いなんて違いに入らない、といった捉え方をされる方は多いと思うので、気にしない方もたくさんいることは理解します。 （私も数年前までそう思ってました。が、新しいテーマで刺激有り無しでの発現量の違いをqPCRで調べたら、Ct値0.2程度の差が再現性良く取れた（私でもテクニシャンがやった場合でも）ので、考えを改めた次第です）

(無題) 削除/引用 No.12311-18 - 2024/05/15 (水) 20:47:23 - たろう ボルテックスミキサーで混ぜる タッピングで混ぜる 混ぜない これら3種類の操作によってCt値は0.3も違いません。 遠心はしないとCt値がばらつきます。 論より証拠で、自分の試薬・手順・機器で試してみるべきです。

(無題) 削除/引用 No.12311-17 - 2024/05/15 (水) 09:49:43 - おお >[Re:15] QODさんは書きました : > 混ぜる混ぜないの議論は宗教みたいなところがあるので踏み込みませんが、対流で混ざるというのは本当でしょうか。あのサイズ、あの形状、あの熱分布で対流？ まあ表面から加熱されるからその時どの程度TubeのWallに近い液体が上昇するかというところでしょうかね。液量が少ない分混ざり方は速いのかもしれない。まあ反論するならそんなところですが、そうだということではないですけど。 色素など使って実際にやってみるとええかなと思うんですけどね。やる時間があればやってみるけど、、、

(無題) 削除/引用 No.12311-16 - 2024/05/15 (水) 09:43:34 - おお PCRさんのケースでは一度数個で混ぜる、混ぜないで差があるかをみて差がないなら混ぜなくていいし、差があれば示されているいずれかのやり方で混ぜればいいと言うのが結論の様に思います。 混ぜるか混ぜないかの議論はそれぞれのやり方で確立したものと考えれば皆さんのやっているやり方でやることを否定はできないと思います。 ８連や１２連のチューブなら蓋が閉まった状態でタッピングしてスピンダウンがやりやすいかと思います。プレートだとたとえばELISAリーダーとかMixのために振動を与える機能があるのでそこに入って詰まったりしないようならそれでもいいのかもしれません。その後念の為スピンダウンしたほうがいいかもしれません。ELISA などのプレート用のMixerもあるようですが。 ボルテックスについては、ボルテックス＝酵素失活と思っているならちょっと違うと思います。ボルテックスは酵素を失活させる可能性のある方法だということです。ボルテックスして安定したデーターが出ているなら何ら問題はないと思います。それに強度も調整できるわけですし。

(無題) 削除/引用 No.12311-15 - 2024/05/15 (水) 08:06:44 - QOD 混ぜる混ぜないの議論は宗教みたいなところがあるので踏み込みませんが、対流で混ざるというのは本当でしょうか。あのサイズ、あの形状、あの熱分布で対流？

(無題) 削除/引用 No.12311-14 - 2024/05/15 (水) 00:46:25 - カネ 教科書的にはタップフラッシュ 気持ち的には熱対流に賛成 PCRプレミックス程度なら 保存が凍結なら混合優先でVortex 制限酵素は不凍だし、教科書的にもタップ 目的にもよるだろうけど もちろん普通の増幅やコロニーPCRなんか テンプレート量もまちまちなんだから 秒のVortexくらいでダメになるなら 他の条件疑う 逆転写やRNA絡むならVortexは怖い 解析とか後に数値データが絡まないのであれば ざっくり酵素の扱いイメージとしては 凍結保存ならVortex 不凍処理ならタップ 繊細だから不凍にしてるんだろ的な意味で いうて自分はだいたい８連レベルだから はじいてプチ八するのは主として底の泡を抜く用 最後になっちゃったけど 主のケースなら何百なんだから 96プレートでテンプレート等を「押し出し」て まとめてチューブシェイカー軽くかけて プレート遠心機でフラッシュが 泡抜き込みで良いんじゃない フラッシュするなら揺らす時間なんて１，２秒だし テンプレ先入れは入れ忘れ防止もかねて有効だと思う 後入れのMIXがチップ先について落ちずに微妙に液量変わったり つい壁につけちゃってチップ交換しちゃったりはするかも そういえば混ぜないなら蓋裏につけて遠心で落とすって古典もあったな

(無題) 削除/引用 No.12311-13 - 2024/05/14 (火) 21:24:26 - T >実験事象を観察する解像度の違い うーん、PCRででは無いが、別の酵素がvortexで失活した例を一つ二つ、私は自分自身で経験しています。で、酵素がvortexで失活する（ことが多々ある）というのは昔から教科書に書かれていることでもあるし、特に反対する理由は無いです。ありますかね？ >混和が不十分だと定量値のばらつきの原因になります 杏里さんはこれを実際に経験されてるということでしょうか？実はこれ、私有り無しでどうなるか調べた（というか、テクニシャンが調べたいと言って試して結果を持ってきてくれた）ことがありますが、結果はRT-qPCRでCt値は全然変わりませんでした。No.12311-2で　が　さんも同じことを仰ってますね。 現実的に、全ての事象を調べるなんて時間の無駄だから皆やらない（この話の場合は、いちいちVortexで酵素が失活するかどうかをまず試そう、なんてことはしない）訳で、ある程度は教科書の原理原則に従うのが普通ではないかと思います。で、かなり特別な理由無しにそれに逆らうことしてたら、そっちの方が最終的に時間食う場面が多いだろうと思うのですが、どうですかね？ いやまあ、杏里さんのところだとVortex無しでは高確率で結果がばらつくんだ、というなら勿論反対する理由は無いですがね。正直、普通そうはならんだろなんか変な手順でやってんじゃないの？とは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12311-12 - 2024/05/14 (火) 20:41:26 - 杏里 試したわけでもないのに、酵素が入っているからVortexはできない、とかお気持ちを優先する人が居るラボと仕事すると、単に混合不足なだけなのに、この差は有意だとか有意じゃないとか無意味な議論に巻きこまれて時間を浪費して正しい結論にも到達できないことになります。 実験事象を観察する解像度の違いとでも言うのかな。

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