いつも拝見させていただいています。
In-Fusion Cloningを用いてJM109を形質転換しましたが、コロニーが1つも形成されませんでした。実験の流れとしては、インサートとベクターをそれぞれＰＣＲにて増幅し、それを電気泳動、ゲル抽出した後に、In-Fusionしています。
気になっている点としては2つ。1つが、In-Fusionの反応液を半分にしたことです。ゲル抽したインサートの濃度が低かったため、インサートの添加量が多くなってしまいました。そのため、In-Fusion酵素の添加量を2倍にする必要がありましたが、酵素は非常に高価でもったいないので、反応系を2分の1にすることで対応しました。
2つ目に、ベクターは制限酵素処理したものを用いるとあったのですが、PCRで増幅したものを用いているという点です。In-Fusionの原理を確認した上で、PCR産物同士のクローニングでも反応可能だと考えていましたが、これが上手くいかない理由なのでしょうか。
特に2番目は気になっている点です。どなたか、同様の経験または解決策などご存じでしたらご教授お願いします。 |
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