いつも勉強させてもらっています。
今、pcDNA3.1(+)にクローニングされた遺伝子Xのtransgenicマウスを作製予定です。
そのため、一度、pcDNA3.1(+)の【CMVプロモーター - Kozak - GeneX - BGHpA】までをTA vectorに移しました。
これをマウスゲノムに入れて、遺伝子Xの過剰発現マウスを作製したいのですが、もしTAベクターに入れたものが完全な遺伝子発現ユニットであるならば、TA vectorを293Tにtransfectionしても、タンパク質Xは発現するはずだと思ったのですが、全く発現が見られませんでした。
このままではtransgenicマウスの作製に移れないため、非常に困惑しております。
pcDNA3.1+に入れた遺伝子Xからは目的のタンパク質Xは293T細胞で認めます（ウエスタンブロット）
そこで確認させていただきたいです。
thermofisher.com/order/catalog/product/V79020
ここにpcDNA3.1+のmapがあります。
このマニュアルの10ページ目に、
CMV promoter: bases 232-819
BGH polyadenylation sequence: bases 1028-1252
と書かれてあります。
私はGeneXがクローニングされたpcDNA3.1+のCMV promoter 232から、BGH polyadenylation sequence 1252までをTAベクターに移しましたが、sequence自体は正しいです。間違いなくこの領域がクローニングされています。
CMV promoterよりも更に上流の配列が必要なのでしょうか？enhancerとかでしょうか・・
非常に困惑してしまい、経験豊富な皆さまからのアドバイスをぜひいただけますと大変幸甚です。
何卒よろしくお願いいたします。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加