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素子です 削除/引用 No.1230-8 - 2012/12/10 (月) 21:26:27 - ぶー子 qqさま ありがとうございます。 類似の酵素の論文と似たようなプロットになったので、これがその酵素の特性なのかと思っていました。 480ｍMのKｍというのは通常はありえないと考えてよいのでしょうか。 実験系を見直してみます。 よろしくお願いします

(無題) 削除/引用 No.1230-7 - 2012/12/09 (日) 20:27:15 - qq Low-affinityのKmが450mMであるというのは、基質が水かNaイオンでない限り、単なるノンスペだということだとおもいます。 あなたも、 ＞ノンスペ分は差し引いているので問題ないとは思うのですが・・・。 と、思っているようですが、それでも差し引けていないものがあるのではないでしょうか？

素子です 削除/引用 No.1230-6 - 2012/12/09 (日) 15:48:52 - 素子 ~~さん ありがとうございます。 類似の酵素の論文ではEadie-Hosteeプロットを用いてKm値とVmaxを推定しています。片方はKmが480mM、もう片方が0.78mMのようでした。 「酵素の活性を測定する際にはKm値よりも高い基質濃度も用いて行う」だと記憶しており、この酵素の至適ｐHやユニットを計算する際に用いるにはどの程度の基質濃度を用いるのが正しいのかわからなくなってしまい、自分の実験が適正か否かが判断つかなくなってしまった次第です。 類似の酵素の論文では至適ｐHなどについての記述はありませんでした。 ユニット数については、用いた基質濃度についての記述はなくお作法通りの記述しかありませんでした。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1230-5 - 2012/12/09 (日) 00:41:38 - ~ 　ある種のトランスポーターにはKmが100mMを超える反応もあるようです。また、"反応が飽和せずにゆるい右肩あがりのグラフに"なることが、"酵素のほうに２つの結合部位（ハイアフィニティとロウアフィニティ）があるらしい"につながるロジックがよく分かりません。右肩上がりのグラフになるときに最初に疑うのは基質濃度が足りていないことです。プラトーまで見たければ基質濃度を上げるしかありません。 　プラトーまでみることはおいておいて、bi-phasicな反応であると考えましょう。この場合、 1. "類似の酵素について書かれている論文"ではどのように解析していますか？ 2. No.1230-2でお示ししたように、スキャッチャードプロットで不都合があるのですか？ この2点を考えれば大体解決すると思うのですが。。。

素子です 削除/引用 No.1230-4 - 2012/12/08 (土) 23:53:06 - 素子 qqさん、~さん。ありがとうございます。 基質濃度は0.05から15mMまでふっているので、低すぎるということはないと思いますし、ノンスペ分は差し引いているので問題ないとは思うのですが・・・。測定条件を見直するとしたらまずどのあたりがポイントになるのでしょう（一般論でしかいえないかと思いますが）。 また、類似の酵素について書かれている論文ではsingle hyperbolic equationよりもdouble-hyperbolic equationのほうがフィットすると書かれてあり、私の結果も似たような感じなのです。 ですので片方のVmaxとKm値は出せるのですが、もう一方のものが出せないため ユニット数を決める時の基質濃度が適正かどうか判断がつかなくて困っています。 ひき続きよろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.1230-3 - 2012/12/08 (土) 18:07:40 - qq ＞最大速度Vmaxが求められず、 とは、最大反応速度が異常に高くなる、もしくは無限大になるということですか？ １）あなたの測定している基質濃度が単に低すぎるだけである。 ２）酵素活性だと思って測定している値が、酵素活性＋非酵素的反応（ノンスペ）である。 の、可能性を思いつきます。 とりあえずLow-affinityの反応を見積り、high-affinityだけを相手にするのが良いかもしれません。 v=Vmax*S/(Km+S) + k*S　　# k*Sがノンスペ として、あなたのv,S値を使って、Km,Vmax, kを求めることが可能でしょう。 仮にそうだとすると、測定条件自体の方を改善する必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.1230-2 - 2012/12/08 (土) 15:14:38 - ~ レセプターだとスキャッチャードでハイロー別々に評価している論文があるみたいです。しかし、VS(SV?)プロットで結合部位が2つあるなんて分かりますかね?? 酵素のユニット自体は定義しだいなので自分で好きに決めれば良いと思います。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12802337

酵素活性単位について 削除/引用 No.1230-1 - 2012/12/08 (土) 13:41:18 - 素子 反応速度論についてはあまり詳しくないです。 ある酵素の活性を測定していてミカエリスーメンテン式のV-[S]プロットをしたら、反応が飽和せずにゆるい右肩あがりのグラフになってしまいました。どうも酵素のほうに２つの結合部位（ハイアフィニティとロウアフィニティ）があるらしいのです。 そうすると最大速度Vmaxが求められず、Km値も得られないことになり、酵素のユニット数がだせないのではないでしょうか？このような酵素の場合、どうやって活性（もしくは活性単位）を求めればいいのでしょうか。 詳しいかた教えてください、よろしくお願いします。

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