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(無題) 削除/引用 No.12296-15 - 2024/05/01 (水) 16:17:43 - noname クローニング用プライマーの外側にポリAをつける意味がよくわからないです。。。PCRかかりにくくなりませんか？

(無題) 削除/引用 No.12296-14 - 2024/05/01 (水) 16:06:36 - プリッツ nonameさん ＞クローニングにつかっているプライマーの制限酵素サイトの外側に数塩基の余白は持たせていますか？ はい、制限酵素の外側にポリAを付加してあります。 具体的にはAが６つついております。

(無題) 削除/引用 No.12296-13 - 2024/05/01 (水) 15:15:13 - プリッツ TSさん ＞インサートの制限酵素処理は適切にできてますか 説明不足で申し訳ありません。おっしゃる通りTAクローニングではなく、環状のベクターと直鎖上のインサートをライゲーションさせています。 インサートは制限酵素サイトが両端に来るように設計したプライマーで増やしたものを使用しており、処理前後で処理の可否をバンドで確認することができない（切れる塩基は２．３程度）のため、同時に環状のpSP64 poly(A) vectorを同条件で処理し、そのベクターがリニアになったかどうかで確認しています。 条件は ・DNA 1ug程度 ・BamH1 2ul ・Hind�V 2ul ・cutsmart buffer 4ul ・upw up tp 40ul で、37℃ 1時間インキュベートしています。 １時間後取り出し、すぐに10×loading bufferを4ul加え、そのまま泳動するという流れになります。

(無題) 削除/引用 No.12296-12 - 2024/05/01 (水) 15:05:03 - TS ＞ライゲーションのストラテジーも再検討したほうがいいかも。どういう手順ですか？ まずcDNAから切り出した配列をインサートとしてExTaqPremierを用いてPCRをします。それを精製後、電気泳動にてバンドを確認し、モル比が3:1になるようにベクターとインサートの量をNEBioCalculatorを用いて決定し、ライゲーションを行っています。ライゲーションは16℃で30分です。この時のDNA量は10ngを超えないように設定しています。 その後ライゲーション液2.5ulをコンピ50ulに入れ、5分氷上、1分42℃、5分氷上した後、SOC150ulに入れ、37℃で一時間振盪培養、そして37℃に温めてあったLB寒天培地に80ulずつ蒔いてO/Nという流れになります。 TAクローニングではなく、MCSを使ってライゲーションされているのですよね。 説明を省略されているなら良いんですが、nonameさんもコメントしているように、インサートの制限酵素処理は適切にできてますか。 PCR->ゲル->精製->制限酵素処理->精製->ライゲーション

(無題) 削除/引用 No.12296-11 - 2024/05/01 (水) 14:10:22 - プリッツ ＧＷさん 生成物を制限酵素で切ってみるという考えはありませんでした。教えていただきありがとうございます。 確かにそれをやればＰＣＲがうまくいっていないのかを確認できますね。 ただ今回は生成物をそのまま泳動に流してもバンドがみられなかったんです… その場合はこの作戦は使えなそうですよね？ Ｇ２５さん ＞「濃度が得られた」って何で見て？ 精製プラスミドはNanodropを用いて測りました。 11.3ng/ulとかなり低い濃度だったのですが、波形のピークはきれいに出ていました。 （話はそれますが普段ほかの実験でプラスミド抽出を行ってもこれくらいの濃度になることが多いです。実験を行う上での支障としては、濃度が薄すぎて液量が足りなくなることくらいで、これはエタノール沈殿で濃くしているので問題はないと考えていますが、やり方が悪いのでしょうか？抽出にはTakaraが出している抽出キットを使用しています。もしよろしければご助言いただけますでしょうか。） ＞ライゲーションのストラテジーも再検討したほうがいいかも。どういう手順ですか？ まずcDNAから切り出した配列をインサートとしてExTaqPremierを用いてPCRをします。それを精製後、電気泳動にてバンドを確認し、モル比が3:1になるようにベクターとインサートの量をNEBioCalculatorを用いて決定し、ライゲーションを行っています。ライゲーションは16℃で30分です。この時のDNA量は10ngを超えないように設定しています。 その後ライゲーション液2.5ulをコンピ50ulに入れ、5分氷上、1分42℃、5分氷上した後、SOC150ulに入れ、37℃で一時間振盪培養、そして37℃に温めてあったLB寒天培地に80ulずつ蒔いてO/Nという流れになります。

(無題) 削除/引用 No.12296-10 - 2024/05/01 (水) 13:54:59 - プリッツ 774Rさん、TSさん ユニバーサルプライマーでのコロニーＰＣＲをやってみます。 ありがとうございます。 また今回コントロールはおかずにライゲーション、形質転換をしていました。 お二人からいただいたアドバイスをもとに、まずユニバーサルプライマーでコロピーにかけてみて、それがなにも得られなかったらライゲーションができていないということでネガコン、ポジコンありでのライゲーション、形質転換をしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-9 - 2024/04/30 (火) 19:20:02 - noname お使いのベクターだと、ユニバーサルなSP6 primerとM13 Primer reverseが使えるので、これでコロPするとよいと思います。 ちなみに、クローニングにつかっているプライマーの制限酵素サイトの外側に数塩基の余白は持たせていますか？それがないとPCR産物の制限酵素サイトはカットできません。

(無題) 削除/引用 No.12296-8 - 2024/04/30 (火) 18:09:00 - G25 プライマリーのプレート上にはライゲーション反応液に入っているインサートDNAも塗り広げられています。インサートDNAを増幅したプライマーでPCRをかければコロニーのあたりあずれに関係なく、なんならコロニーの生えていないところをつついたってPCRがかかります。PCRで増えたのはそういうわけだったのでしょう。レプリカプレートにはライゲーション反応液の持ち込みはないので、PCRがかからなかった。 >増えた細菌からプラスミド抽出をすると濃度は得られますが、それを電気泳動に流しても、バンドは全く見られませんでした。 非組換プラスミドのコロニーを拾った可能性を考えていたのですが、空ベクターのバンドもまったくなかったという事でしょうか？　だとしたら、アンピシリンがヘタっているとか、なにか全く別の細菌を殖やしていたと？　「濃度が得られた」って何で見て？　RNAやその残骸が残っていると大きく吸光しますよ。 他の方の指摘のように、コロニーPCRのプライマーはインサートではなくベクター上の配列に設計すること。 全然当たりが出ないようなので、ライゲーションのストラテジーも再検討したほうがいいかも。 どういう手順ですか？

(無題) 削除/引用 No.12296-7 - 2024/04/30 (火) 17:03:18 - GW 担当教員がいるならある程度の検証は終わってそうだけど 精製プラスミドができてるのか空のままなのかは 今ある精製プラスミドが1000ng/uLとして 1uL＋Dye泳動でバンドが見えるか それを使って Hind Bam H＋B（メーカーにもよるけどダブルで） のパターンで切って想定のバンドが出るか 出るならモノは正しくできていてコロニーPCRが問題 （ただし液培前コロニーでは見えてるから想定のバンドは出るはず） だからシーケンスでインサートかかるか一度見てみるか 液培中にプラスミドが落ちてるか空の菌が増えてるか とかなら 植菌時のコロニー（形質転換後１回目のコロニーPCRだから出るはず） 前培養液 本培養液（精製前） のペレットかなんかつついて 精製後のプラスミドも鋳型にして 同じ条件でコロニーPCRしてみるとか

(無題) 削除/引用 No.12296-6 - 2024/04/30 (火) 16:49:17 - TS それとライゲーションのポジコンはありますか。クローニングのための増幅ができている（ここができないと苦しむ）ようなので、一つ一つ原因をつぶしていけば、成功にたどり着くと思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-5 - 2024/04/30 (火) 16:46:11 - TS 774Rさんがおっしゃる通り、それだとライゲーションの成功に関わらず、PCRがかかります。 もしMCSを挟むようなシーケンスプライマーをもっていれば、それでコロニーPCRできると思います。 ライゲーション、形質転換の時に、インサートなしのネガコンはもっていますか。今の情報からですと、セルフライゲーションか、制限酵素で切れきれなかったものが、コロニーとして出ているような感じがしますが、ネガコンがあればおおよそわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-4 - 2024/04/30 (火) 16:19:50 - 774R >すなわちベクターに多少かかっている（制限酵素の分なので2-3bp分）と思います。 ただのPCR断片が存在しているのか、ベクターにライゲーションされたものが存在するのかを見極めるためには、ベクターに多少かかってるだけでは全く意味がありません。 少なくとも片方のプライマーはインサートにかからずベクター上に設定する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.12296-3 - 2024/04/30 (火) 16:14:43 - プリッツ TSさん 使用しているプライマーは自分で設計した特異的プライマーで、タンパクA、Bの上流と下流に制限酵素サイトを付与したものになります。 ベクターとインサートをそれぞれ制限酵素（Hind�VとBamH1）を用いてカットし、それを使ってインサートの増幅を行い、増幅されたインサートをライゲーションに使用するという流れです。 すなわちベクターに多少かかっている（制限酵素の分なので2-3bp分）と思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-2 - 2024/04/30 (火) 15:51:49 - TS コロニーPCR用のプライマーは、クローニングしようとしている配列の外側（ベクターの配列）にかかっていますか。配列の内側だと、ライゲーションの有無にかかわらず、PCRがかかってしまうことが少なくないです。

形質転換体が得られない 削除/引用 No.12296-1 - 2024/04/30 (火) 15:38:59 - プリッツ 初めて投稿させていただきます。 現在２種類のタンパク質（それぞれタンパクA、タンパクBとさせていただきます）を目的タンパク質とし、それぞれ二種類をベクターとライゲーションさせ、形質転換を行った後、コロニーPCRによってインサートチェックをし,レプリカ体を作成するとともに液体培養にて形質転換体を大量培養しようとしております。そして培養後にはプラスミド回収をしたいと考えております。 しかし形質転換後、１回目のコロニーPCR後の電気泳動で目的の高さにバンドがみられるも、それ以降の工程ではバンドが全く得られないという状況にあります。レプリカを再度PCRにかけても、液体培養にて増えた細菌を使ってPCRしても、いずれもバンドが得られません。 （レプリカを再度PCRした際、一度だけうすーーーくバンドが見えあたことがありましたが、それ以降の結果は同じでした） 増えた細菌からプラスミド抽出をすると濃度は得られますが、それを電気泳動に流しても、バンドは全く見られませんでした。 以下に使用したものを並べます。 ・コンピ　DH５a ・ベクター　pSP64 poly(A) vector ・タンパクA　1500bp ・タンパクB　1000bp ・培地　LB(アンピシリン濃度100ug/ml) ・形質転換後LB寒天培地にて、37℃で１６時間培養 ・PCR　すべてGoTaqを使用　30サイクル どなたか同じような状況に陥ってしまった経験のある方がいらっしゃいましたらご助言いただきたいです。 研究室の担当教員に聞いても経験がないそうで解決策は得られませんでした。 上記のような流れを何度も繰り返し、また１度ライゲーションからやり直してみたのですが、やはり結果は同じでした。 これ以上繰り返すのは時間がもったいないと考え、質問させていただきます。 よろしくお願いします。

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