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(無題) 削除/引用 No.12296-35 - 2024/05/02 (木) 21:25:26 - プリッツ おおさん ＞大腸菌がそのインサートによる影響で生理的に好ましくない状態になるなら、それを低減するためにインサートを含むプラスミドのコピー数を下げた状態で大腸菌を増殖させるのが狙いです。 なるほど。そのような方法は初めて知りました。教えていただきありがとうございます。 GWさん ＞昨日から本日にかけ、同じコロニーを使って二種類のコロピー（ユニバーサルプライマー（M13RとSP6）を用いたコロピーと自作の特異的プライマーを用いたコロピー）を実施しましたが、ユニバーサルプライマーのほうは何も増幅がみられず、特異的プライマーのほうのみバンドがみられました。（タンパクA、Bともに高さはばっちり） コロピーは30サイクル行い、電気泳動にはPCR産物を5ul流しました。 このことからやはりライゲーションはできていなくて、特異的プライマーによるPCRで増幅できていると思っているものはバックグラウンドということでしょうか…。 しかしユニバーサルプライマーによるPCRで、もしインサートが入っていないのであればMCSの増幅がみられると予想していたのですが、全く見られないというのが疑問です。それならば増えているコロニーは何なのでしょう…？ ちなみにコロニー数は100以上あります。というより、ざっと見るだけで500は超えていると思います。 G25さん ＞過去トピ参照 ありがとうございます。読んでみます。 ＞わたしが言っているのはPCR産物の両端がちゃんと切れているかどうかをチェックする方法です。 完全消化されていることはまずありませんし、消化の程度もまちまち、ときにほとんど切れていないこともあるので、そうしてチェックしてみるのは有用です。 もう一度送ってくださったリンクを読み直し、やっと理解ができました。 理解力不足で申し訳ありません。 インサートのみでライゲーションさせるという考えは全く思いつかなかったです。確かにそれをやれば確かめられますね。ありがとうございます。 試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-34 - 2024/05/02 (木) 12:52:13 - G25 > の順で行っていますが、私のやり方とG25さんのおっしゃるやり方はどのように違いますでしょうか？理解力不足で申し訳ありません。 > pSP64を同時に制限酵素処理する理由としましては、cutができたかどうかの指標とするとともに、その後ライゲーションで使うためという2つの理由から行っています。 リンク先の書き込みは読んでくれましたか http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=10784 わたしが言っているのはPCR産物の両端がちゃんと切れているかどうかをチェックする方法です。 完全消化されていることはまずありませんし、消化の程度もまちまち、ときにほとんど切れていないこともあるので、そうしてチェックしてみるのは有用です。 同時に消化したプラスミドが完全消化されているかどうかなんて全く指標になりません。

(無題) 削除/引用 No.12296-33 - 2024/05/02 (木) 12:41:10 - G25 >一つお聞きしたいおですが、コンピを増やす際に30℃くらいでやるというのはどのようなメリットがあるのでしょうか？増殖が進み衛星などの目的プラスミドが増えてしまうのを防ぐという理由からであっていますでしょうか？ pUC系の多コピーレプリコン（500~1000 copy/cell) のoriは温度感受性変異体で、30℃以下になると野生型のコピー数(~30 poly/cell, pBR322など）になります。 過去トピ参照 https://www.google.com/search?q=site%3Awww.kenkyuu2.net%2F+%E3%83%97%E3%83%A9%E3%82%B9%E3%83%9F%E3%83%89+%E6%AF%92%E6%80%A7%E3%80%80leaky&client=firefox-b-d&sca_esv=782705a13c1e22f4&sxsrf=ACQVn0814cNR_KoNL5vBY0ae6eNhDufeSQ%3A1714618068330&ei=1P4yZpzdE7am2roPwsKU6A0&ved=0ahUKEwicl42H-u2FAxU2k1YBHUIhBd0Q4dUDCBA&uact=5&oq=site%3Awww.kenkyuu2.net%2F+%E3%83%97%E3%83%A9%E3%82%B9%E3%83%9F%E3%83%89+%E6%AF%92%E6%80%A7%E3%80%80leaky&gs_lp=Egxnd3Mtd2l6LXNlcnAiNXNpdGU6d3d3Lmtlbmt5dXUyLm5ldC8g44OX44Op44K544Of44OJIOavkuaAp-OAgGxlYWt5SOqeAVC3BFiHnQFwBHgAkAEAmAFloAHXD6oBBDIxLjG4AQPIAQD4AQGYAgCgAgCYAwCIBgGSBwCgB-II&sclient=gws-wiz-serp#ip=1

(無題) 削除/引用 No.12296-32 - 2024/05/02 (木) 12:16:08 - GW 個人的には Lig反応液をまいたプレートからはインサートバンドがあって コロニーができてるのに抗Ampのプラスミドが泳動で見れないのが 一番怪しいなと思ったから結果待ちだけど 1年の経験があるし他サンプルでの成功例があるなら 今回のだけ同条件でうまくいかないのは つつき方が悪かったり手順的なミスじゃなくて 配列に致命的な点があるのかなとも思う 横からだけど TF30℃ってのは 本人の言う通りのマイルドさなんだろうけど 単純にTFでクリティカルな工程って「そんなに」ないから サテライトも含め37℃o/nで翌朝一が理想なのは前提として 金曜日にＴＦ用反応液までできたけど月火でＴＦすると 月曜午前もったいないなーとという時 とりあえず金曜夜に撒いて室温でほったらかして 月曜朝にデカいコロニーの中央表面からつついてみたらワンチャンいけるか くらいのスケジュール的なメリットもあったりなかったり いつものコロニー数が100個以上/枚とかの多さでなければの話

(無題) 削除/引用 No.12296-31 - 2024/05/02 (木) 11:27:30 - おお >[Re:30] プリッツさんは書きました : > おおさん > > > 一つお聞きしたいおですが、コンピを増やす際に30℃くらいでやるというのはどのようなメリットがあるのでしょうか？増殖が進み衛星などの目的プラスミドが増えてしまうのを防ぐという理由からであっていますでしょうか？ 大腸菌がそのインサートによる影響で生理的に好ましくない状態になるなら、それを低減するためにインサートを含むプラスミドのコピー数を下げた状態で大腸菌を増殖させるのが狙いです。

(無題) 削除/引用 No.12296-30 - 2024/05/02 (木) 11:09:06 - プリッツ おおさん 多くのアドバイスをありがとうございます。 確かに皆さんからいただいたアドバイスをもとにたどっていってもうまくいかなかったらcDNAからやり直してみる必要があると思いました。 一つお聞きしたいおですが、コンピを増やす際に30℃くらいでやるというのはどのようなメリットがあるのでしょうか？増殖が進み衛星などの目的プラスミドが増えてしまうのを防ぐという理由からであっていますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12296-29 - 2024/05/02 (木) 11:04:36 - プリッツ SYBR masterさん ＞Nanodropは使用者の力量が反映する(=それまでの使用方法や、その時使用する測定方法に依存する)ので、その濃度は正しいですか？電気泳動での濃度が明らかなDNAマーカーとの比較で比べてみてください。Nanodropので提示された濃度がおかしいこと(明らかに使い方だと思うんですけどね。最初にBlunkで核酸が含まれていないTEとか測定しておけば良いんだけど)は、結構海外でも話題になっています(ThermoのQubitとの測定した濃度比較と、電気泳動の結果が並列で出されていたと思います)。 濃度測定前にはUPWで濡らしたキムワイプで測定部位を優しく拭き、その後TEバッファーでブランクを取ってから測定しています。ただ、確かに明らかに濃度が電気泳動のマーカーと合わないことが以前ありましたので、今回も測定値がおかしかった可能性はあるかもしれません。 ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12296-28 - 2024/05/02 (木) 11:00:24 - プリッツ G25さん ＞Hind3/BamH1 cutのインサートをPCRで増幅して、pSP6のHind3/BamH1 cutにライゲーションしたということ？ 言葉足らずで申し訳ありません。 Hind�V/BamH�Tサイトを付加したインサートを増やし、それを精製後cutしています。 ＞制限酵素処理したPCR産物を一部取って（精製または熱失活で酵素を不活性化して）、それだけでライゲーション反応すれば末端が切断されているかどうかわかります。制限酵素切断された末端同士でライゲーションしてPCR産物の重合が起こるからです。切断されていないPCR産物はモノマーのまま。 インサート増幅→精製→制限酵素処理→酵素不活性化（loading buffer使用）と同時に電気泳動→精製→ライゲーション の順で行っていますが、私のやり方とG25さんのおっしゃるやり方はどのように違いますでしょうか？理解力不足で申し訳ありません。 pSP64を同時に制限酵素処理する理由としましては、cutができたかどうかの指標とするとともに、その後ライゲーションで使うためという2つの理由から行っています。

(無題) 削除/引用 No.12296-27 - 2024/05/02 (木) 10:50:54 - プリッツ G25さん ＞バンドは全く見られなかったとありますが、結局、プラスミド精製してもプラスミドがなかったということなのか、プラスミドはあったっけどインサートのバンドがなかったということなのか？ バンドは全く見られませんでした。セルフライゲーションのものもです。ゲル状ではマーカーのみがきれいに光っていました。 GWさん ＞10ng/uLのプラスミドならあるけど見えてないだけかもと疑う 今回２ul流したので20ngはあるのですが、それが少なすぎたのでしょうか… 流す量を増やして流しなおしてみます。

(無題) 削除/引用 No.12296-26 - 2024/05/02 (木) 09:24:34 - プリッツ noname さん > クローニング用プライマーの外側にポリAをつける意味がよくわからないです。。。PCRかかりにくくなりませんか？ 説明不足で申し訳ありません。このプライマーを作成した当時(約一年前)は、研究室に入室したばかりで分子生物学などやったことがなく、技術習得もかねてTAクローニング→MCSを使ったpSP64への乗せ替えという流れで研究を進める予定でして、そのためにポリAつけておけばA付加する必要ない&制限酵素サイト前に数塩基付けれるで一石二鳥！という考えでそうしました。

(無題) 削除/引用 No.12296-25 - 2024/05/02 (木) 07:07:00 - おお もし、cDNAからのPCRでゲルから切り出して精製してないようでしたら、することをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.12296-24 - 2024/05/02 (木) 00:52:15 - おお >[Re:22] SYBR masterさんは書きました : > > >[Re:14] プリッツさんは書きました : > > はい、制限酵素の外側にポリAを付加してあります。 > > 具体的にはAが６つついております。 > > 多分杞憂だと思うけど、30年前にそこら辺のことを習ったとき(たぶん今のThermoかIDTだともうんだけど)は、何にも考えず「GAGAGAの6塩基付けとけ」と習った記憶だけ有り、現在もそのように作成しています。 わたしはGとCを使った配列にすると言うのをどこかで見たことがありますのでそうしてます（片側をCGCGとしてもう一方をGGCCとか、大体３から４塩基延長）。おそらく末端をなるべく安定化させてきれやすくするのが狙いと思われます。

(無題) 削除/引用 No.12296-23 - 2024/05/02 (木) 00:45:11 - おお 私はcDNAのPCRから疑ってやり直します。最適化の条件は目的のバンドが見れるMaxの温度としてます。同時にPCRの酵素を変えることが多いです。 コロニーPCRでプライマーの設定があまり良くないという指摘はそうだと思いますが、両末端違う制限酵素をつかいセルフのLigationがかからない設定で数個調べても入っていないというのはそれ以前の問題も引きずっていると思います。 ベクターがちゃんと切れていたのか（インサート用のPCR Productsもしかり）、 Ligationはうまく行っているのか、 コンピテントの効率は十分だったか、 電気泳動からの切り出しのときにUVをなるべく当てない工夫をしているか、 などなどチェックポイントはたくさんあります。Bam-Hindのカットなのでアルカリフォスファターゼ処理は理想的な状況では必要ないですが、どちらかの酵素の切れ残りがあれば結構なTransformation活性を呈するので念の為にやってもいいでしょう。 ポジコン、ネガコンなどと比較して系がしっかりワークしていることがわかるなら、コロニーPCRせずともミニプレップして、制限酵素で切ってインサートを確認すれば相当な確率で入っているのがたいていですからコロニーPCRのステップはスキップできるもんです。あとコロニーPCRでポジだったら目的のプラスミドが取れているとするのはちょっと危ういです。PCRがかかっている部分しか見てないですから。 たまにInsertがどういう理屈かわからないけど大腸菌に悪さしている場合があります。そのための工夫はいくらかありますが、TF後プレートに大腸菌をまいて、室温から３０度ぐらいでコロニーを作るというのも一つの方法です。アンプの濃度も下げる手があります。最低２５ug/ml入っていたらセレクションはかかります（環境などによって若干変わるかもしれないので確認は必要かもしれません）。

(無題) 削除/引用 No.12296-22 - 2024/05/02 (木) 00:00:15 - SYBR master えーっと、連休中なので、一つ一つ順を追って >[Re:10] プリッツさんは書きました : > ＞「濃度が得られた」って何で見て？ > 精製プラスミドはNanodropを用いて測りました。 > 11.3ng/ulとかなり低い濃度だったのですが、波形のピークはきれいに出ていました。 Nanodropは使用者の力量が反映する(=それまでの使用方法や、その時使用する測定方法に依存する)ので、その濃度は正しいですか？電気泳動での濃度が明らかなDNAマーカーとの比較で比べてみてください。Nanodropので提示された濃度がおかしいこと(明らかに使い方だと思うんですけどね。最初にBlunkで核酸が含まれていないTEとか測定しておけば良いんだけど)は、結構海外でも話題になっています(ThermoのQubitとの測定した濃度比較と、電気泳動の結果が並列で出されていたと思います)。ちなみ、他の研究室ですが、自分の所でのNanodropのデータが信じられなくて、私の所のQubit使いに他研究室の院生が、院生同士の口伝て来たことがあります(その後NanodropのデータがおかしくてQubitが正しかったので、Nanodropをメンテナンスに出したくらい)。 >[Re:11] プリッツさんは書きました : > ただ今回は生成物をそのまま泳動に流してもバンドがみられなかったんです… このresultは上記と関係ありますか？だとしたら、濃度の見込みが間違っていませんか？アガロースゲルでの電気泳動で、少なくとも20 ng有ればEtBr染色であれ、他の蛍光染色でもバンドとして確認できると思います(検出感度の問題ですが)。個人的には視認しやすいので、100 ng程度に成るように濃度を調整して泳動しています。 >[Re:13] プリッツさんは書きました : >vectorを同条件で処理し、そのベクターがリニアになったかどうかで確認しています。 電気泳動では見えないレベルで、環状やsingle-cutのvectorが存在します。可能なら、2-cutしたあとで、標的DNAをアガロースゲルで回収した方が、その後のクローニング効率が上がります。 >[Re:14] プリッツさんは書きました : > はい、制限酵素の外側にポリAを付加してあります。 > 具体的にはAが６つついております。 多分杞憂だと思うけど、30年前にそこら辺のことを習ったとき(たぶん今のThermoかIDTだともうんだけど)は、何にも考えず「GAGAGAの6塩基付けとけ」と習った記憶だけ有り、現在もそのように作成しています。その理由は覚えていないけど(基本こんな強引なこと企業は言わないので)、たぶんTmの平行化だと思います。あと、オリゴDNAはケミカルな合成なので(3'から５'に向かう)、同一塩基を続けない方が合成効率が少しだけ上がったような記憶もあるんだけど、あまり確かなデータは無いです。

(無題) 削除/引用 No.12296-21 - 2024/05/01 (水) 16:44:47 - G25 12296-8 で問いかけた、 >>増えた細菌からプラスミド抽出をすると濃度は得られますが、それを電気泳動に流しても、バンドは全く見られませんでした。 >非組換プラスミドのコロニーを拾った可能性を考えていたのですが、空ベクターのバンドもまったくなかったという事でしょうか？　 バンドは全く見られなかったとありますが、結局、プラスミド精製してもプラスミドがなかったということなのか、プラスミドはあったっけどインサートのバンドがなかったということなのか？

(無題) 削除/引用 No.12296-20 - 2024/05/01 (水) 16:43:34 - G25 AAAAじゃだめなんですか？

(無題) 削除/引用 No.12296-19 - 2024/05/01 (水) 16:38:35 - noname >[Re:18] G25さんは書きました : > PCRプライマーの5'末端に制限酵素認識配列を付加するとき、末端ギリギリだと制限酵素が切断できないので、さらに数ヌクレオチド付加するという常套手段です。 それは理解しています。ただ、わざわざポリAにする意味がわからないということです。

(無題) 削除/引用 No.12296-18 - 2024/05/01 (水) 16:29:54 - G25 >クローニング用プライマーの外側にポリAをつける意味がよくわからないです。。。PCRかかりにくくなりませんか？ PCRプライマーの5'末端に制限酵素認識配列を付加するとき、末端ギリギリだと制限酵素が切断できないので、さらに数ヌクレオチド付加するという常套手段です。

(無題) 削除/引用 No.12296-17 - 2024/05/01 (水) 16:26:28 - G25 12296-12の記述 >まずcDNAから切り出した配列をインサートとしてExTaqPremierを用いてPCRをします。それを精製後、電気泳動にてバンドを確認し、モル比が3:1になるようにベクターとインサートの量をNEBioCalculatorを用いて決定し、ライゲーションを行っています。 12296-3の記述 >ベクターとインサートをそれぞれ制限酵素（Hind�VとBamH1）を用いてカットし、それを使ってインサートの増幅を行い、増幅されたインサートをライゲーションに使用するという流れです。 ん？　Hind3/BamH1 cutのインサートをPCRで増幅して、pSP6のHind3/BamH1 cutにライゲーションしたということ？ Hind3/BamH1 cutのインサートをPCRで増幅したらblunt endになるからHind3/BamH1のベクターにはつながらない。 PCR増幅したインサートの末端を制限酵素消化したものをライゲーションに使わなきゃ。 単なる記述上の勘違いか？　実際にそうやったのか？　それとも私が読み違ってる？ >処理前後で処理の可否をバンドで確認することができない（切れる塩基は２．３程度）のため、同時に環状のpSP64 poly(A) vectorを同条件で処理し、そのベクターがリニアになったかどうかで確認しています。 制限酵素処理したPCR産物を一部取って（精製または熱失活で酵素を不活性化して）、それだけでライゲーション反応すれば末端が切断されているかどうかわかります。制限酵素切断された末端同士でライゲーションしてPCR産物の重合が起こるからです。切断されていないPCR産物はモノマーのまま。 こうして確かめてみると、PCR産物の両末端をプライマーに設計した認識配列で制限酵素消化するというのは経験上、非常に効率が悪い。「足場」として5'側に数塩基、余剰にしたとしても。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=10784

(無題) 削除/引用 No.12296-16 - 2024/05/01 (水) 16:24:04 - GW ＞ただ今回は生成物をそのまま泳動に流してもバンドがみられなかった 濃度が思ったより薄かったから 制限酵素処理が1ug系でやってるなら処理後液ままでも50ng分 のインサートが見える環境として 10ng/uLのプラスミドならあるけど見えてないだけかもと疑う 少なくとも 空ベクターが同濃度で泳動撮影環境的に見えるかどうか、 できれば空ベクターと問題のLigation産物で同時にTF 同時に培養、精製して10ng/uLに合わせて バンドの見え方に違いが出るか それでも空ベクターのバンドのみ出るなら 濃度は正しくてもプラスミドができてないとわかるし 両方見えないなら 泳動濃度マシマシにするか エタ沈でもなんでもいいけど miniprepの抽出量半分にするか P1前培養ペレットに培養液足すなりして溶出時濃度50ng/uLレベルにすれば 濃度薄すぎて見えないなんてことはないんじゃない

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