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(無題) 削除/引用 No.12296-55 - 2024/05/15 (水) 15:09:01 - プリッツ みなさん たくさんのご助言をありがとうございました。 インサート同士のライゲーションを試し、ライゲースがダメになっていたことが分かったため、新品のもの（研究室にあったもの）を使い、一連の作業を行ったところ、見事にうまくいき、プラスミドの抽出まで持ってくることができました。 本当にありがとうございました。 今後もお世話になることがあるかもしれませんが、その際にはぜひよろしくお願いいたします。 とおりすがりさん ＞ベクターのカット、電気泳動後の切り出しってどうやってされてます？ 切り出しではなく、精製キットを用いて精製しおります。 また泳道後はLEDで見ていますので、そこの心配はないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12296-54 - 2024/05/09 (木) 19:12:53 - G25 >UVでされているようでしたら短時間にしないとligationがうまくいかない経験が何回もあります ライゲーションがうまく以下ないのではなく、UVによるピリミジンダイマー（チミンダイマー）形成が主たる原因です。 良く使われる宿主はRecA-で、ピリミジンダイマーを修復することができず、プラスミドが入っても複製不能。

(無題) 削除/引用 No.12296-53 - 2024/05/09 (木) 17:58:54 - とおりすがり ligaseの問題があるとの書き込みも拝見しました。 もしligaseを再度購入されて試すくらいなら、予算的に可能であるならばligase使わずに、infusionやgibsonでインサートを入れるのもいいのでは？と思ったりもしました。

(無題) 削除/引用 No.12296-52 - 2024/05/09 (木) 17:55:57 - とおりすがり ところで根本的なところで、Hind�VとBamHIでベクターをカットされているとのことでしたが、 ベクターのカット、電気泳動後の切り出しってどうやってされてます？ UVでされているようでしたら短時間にしないとligationがうまくいかない経験が何回もあります。 LEDで切り出して精製したvectorならきっと問題ないのだろうとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12296-51 - 2024/05/08 (水) 18:35:03 - プリッツ G２５さん ＞抗生物質選択が効いていない、非形質転換体が生え、それを拾っい殖やしているという疑いが濃厚になってくるんですけど。 形質転換なしのネガティブコントロールなんか見てますか？ アンピシリンなんかストック溶液でも培地でも保存中にわりとへたりやすい。 今回ネガティブコントロールはおいていませんでした。 アンピシリンは昨年の１１月に作成したものを１ｍLずつチューブに分注し、普段は-20℃で保存しております。それを使う際に融解し、使い終わったらまた凍結させています。チューブ１本に対して凍結融解の回数はおおよそ５回〜１５回ほどだと思います（寒天培地を大量に作るときと、液体培地用に少しずつ使う時でばらつきがあります） 液体培地は液体培養をする際に作成し、寒天培地は作成してからだいたい２週間経たないうちに使うようにしています。

(無題) 削除/引用 No.12296-50 - 2024/05/08 (水) 18:29:57 - プリッツ oyajiさん ＞PCR産物をまずはいつものベクター（青白選択など）に入れ、確実にミニプレップ。 増えたものを、遺伝子組み換え・・・という古典パターンを進めます。 やはりそうなんですね…。 TAからやり直すのも考えてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12296-49 - 2024/05/08 (水) 18:27:43 - プリッツ TSさん ＞Ligation反応は実績あるのでしょうか（ポジコンとか） １つ下のスレッドにも書いたのですが、もしかしたらライゲースがダメになっているのかもしんれません…

(無題) 削除/引用 No.12296-48 - 2024/05/08 (水) 18:26:39 - プリッツ G25さん、おおさん 昨日から本日にかけて、インサート同士でのライゲーションを行いました。 まず初めにタンパクA、B（配列の両端に制限酵素サイトがあり、そこを切断。酵素処理後の電気泳動でバンド確認）においてライゲーションを行いましたが、その後の電気泳動でバンドが一本しか見られなかったです。 このことより ・酵素処理ができていない ・ライゲースがダメになっている の2パターンの予想をたてました。 そこで別のタンパク（2000bp）を用いて制限酵素処理＆ライゲーションを行いました。このタンパクは約1000bpの位置にHind�Vの配列を持っているので、酵素処理後はちょうど1000bpの断片になるものです。 タンパクA,Bで行った際と同条件でHind�Vを用いて酵素処理をし、電気泳動にて1000bpの位置にバンドを確認できたので、精製し、ライゲーションを行いました。 ライゲーション後電気泳動にてバンドを確認すると、やはりバンドは一本しか見られず、２倍、３倍に長くなったものは見当たりませんでした。 以上のことより、今回の一連の流れはライゲーションができていないことによる失敗という認識になりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12296-47 - 2024/05/08 (水) 18:14:20 - プリッツ おおさん ＞ベクター　pSP64 poly(A) vectorが自身で増やして保存しているようでしたら、なるべくオリジナル（最初の）チューブからTFして新しく精製してみてください やってみます。ありがとうございます。 ＞コンピは自作ですか？ コンピは販売れているものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.12296-46 - 2024/05/08 (水) 15:51:51 - G25 >ちなみにコロニー数は100以上あります。というより、ざっと見るだけで500は超えていると思います。 コロニー数が非常に多いこと、しかしコロニーPCRはネガティブっぽい（おそらくライゲーション反応液中のインサートDNAのキャリーオーバーから偽陽性）こと、コロニーをピックアップしてプラスミド精製しても何も取れない（空ベクターさえも）となると、、、、、 抗生物質選択が効いていない、非形質転換体が生え、それを拾っい殖やしているという疑いが濃厚になってくるんですけど。 形質転換なしのネガティブコントロールなんか見てますか？ アンピシリンなんかストック溶液でも培地でも保存中にわりとへたりやすい。

まずは初心に戻り 削除/引用 No.12296-45 - 2024/05/08 (水) 11:17:43 - oyaji PCR産物をまずはいつものベクター（青白選択など）に入れ、確実にミニプレップ。 増えたものを、遺伝子組み換え・・・という古典パターンを進めます。 BamHIは組み換えのサイトとして避けるようにしています。 （普通は入りますが、、、ダメな場合も、、、） PCR産物を制限酵素処理して、直接入れるのは、「うまく行く場合もあるけど」という方法です。古典的な方法であれば、歩留まりが良ければ、３つ拾えば入っています。したがってPCRスクリーニングは不要。逆にいうと、３つ拾ってダメな場合は、どこかのステップが上手くいってない可能性がある。

(無題) 削除/引用 No.12296-44 - 2024/05/07 (火) 10:57:35 - TS >しかしユニバーサルプライマーによるPCRで、もしインサートが入っていないのであればMCSの増幅がみられると予想していたのですが、全く見られないというのが疑問です。それならば増えているコロニーは何なのでしょう…？ ちなみにコロニー数は100以上あります。というより、ざっと見るだけで500は超えていると思います。 空ベクターでもPCR産物はあるはずです。 インサートのサイズは、1000-1500 bpでしたか。 空ベクターのPCRだと、150 bpくらいのが増幅すると思います。 ゲルはこのサイズがみられる％でしょうか。 だとすると何かベクターがおかしそうです。 他の方も指摘されていますが、もし古ければ、ベクターを増やしなおした方が良いかもです。 Ligation反応は実績あるのでしょうか（ポジコンとか）。

(無題) 削除/引用 No.12296-43 - 2024/05/07 (火) 08:59:56 - プリッツ GWさん ＞コロニー底の撒いた液まで触っちゃうから コロニー底の蒔いた液を拾うという発想がありませんでした。つまりコロニーをつつく際には寒天培地に触れない程度にしておくことが大事なのですね。 勉強になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12296-42 - 2024/05/07 (火) 08:57:25 - プリッツ G25さん ＞室温で放置です ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12296-41 - 2024/05/03 (金) 07:42:36 - おお ちなみにPCR Productsを切る場合、切ったものをLigationすれば切れたもの同士でコンカテマーを形成して２倍、３倍の長さのものができます。それを電気泳動で流して、二倍、できれば３倍以上のものを回収して（モノマーを捨てる）、もう一度制限酵素で切れば末端が制限酵素で切れているPCR Productsが濃縮されます。いくらかでもちゃんと切れたものがあればベクターに入ってくれますのでそこまでやる必要もないかもしれません。 またPCR Productsを切るまえに末端をリン酸化してLigation後に制限酵素で切るとPCR Productsの末端で切れにくいというのを回避できる場合があります。場合によっては視覚的にも切れているのがわかりやすいかも。

(無題) 削除/引用 No.12296-40 - 2024/05/03 (金) 01:25:09 - おお ちなみにコンピテントは自作ですか？

(無題) 削除/引用 No.12296-39 - 2024/05/03 (金) 01:22:21 - おお ３０度と書きましたが、私も個人的には室温放置です。３０度に設定するインキュベーターもないですし。週末なので来れない日があるような場合も室温放置することもまあまああります。別に３７度でプレインキュベーションはしません。 ＞昨日から本日にかけ、同じコロニーを使って二種類のコロピー（ユニバーサルプライマー（M13RとSP6）を用いたコロピーと自作の特異的プライマーを用いたコロピー）を実施 M13Rと逆側は特異的プライマーと言う手もありますね。 でM13RとSP6でバンドが出ないとのこと。 えっと前のコメントでかき忘れているかもしれませんが、ベクター　pSP64 poly(A) vectorが自身で増やして保存しているようでしたら、なるべくオリジナル（最初の）チューブからTFして新しく精製してみてください。凍結融解の繰り返しなどでベクターにニックが入っていたりしてTrancationが起こりやすいとか、たまたま変なクローンからベクターを精製してしまったとか（推論ですが）そういうことがなきにしもあらずです。実際にどうしてもうまくいかなくってニッチもサッチもいかなくて、ベクターを大腸菌から精製し直したらすんなり目的のクローンが取れたというのに実際に遭遇したことがあります。まあ相当レアーなケースなのかもしれませんが。 また、インサートが入らない状況なら末端がセルフライゲーションできないような場合、大腸菌内で修復系の酵素などを使ってつなぎ合わせることもあるのだと思っています、その時大腸菌内ですでに末端が削られていたりすればマルチクローニング付近の配列は削られてしまっているかもしれません。ただしその場合はTFの活性はかなり悪い（要するにバックグランドれべる）はずです。

(無題) 削除/引用 No.12296-38 - 2024/05/03 (金) 01:03:11 - GW ユニバの事はnonameさんが触れてたからそっちの方が詳しそう。。。 自分の印象としては確かに謎現象 そこまでいくと自作コンピに過去のAmp耐プラスミド混入してるとか プレートのAmp失活してる？まで疑っちゃうことになるけど とりあえず自作プライマーの挙動が信用できないから 濃度がある液自体のバンドが見れればいいな コロニーに関しては 低温培養の話が出たから スケジュール調整にも使ってたなって例をあげただけで それが目的物の成功確率をあげるとかそんな話じゃない 教員の話を聞く限り 目的はピックアップができる程度の大きさのコロニーを作る事だから 37℃じゃ増えすぎてサテライトも大きくなっちゃうけど 25℃を2日以上でも増えなさすぎて0.1mm径とかじゃつつきにくい・コロニー底の 撒いた液まで触っちゃうから 37℃一晩＋αで増えすぎるので 温度下げて時間を稼ぐ場合でも 自分がラボにいる間は37℃で初期増をさせたら？ 程度の意味だと思う 転換効率も入れたDNAの状態・ラボ環境によるから ざっくりやって、できたら良し その時増えすぎたり出なさすぎたりだったら 次回時短する時に温度調整するか程度 ただ 元の濃度が低くてライゲーションの成否もイマイチなのに 500レベルでコロニー出てくるのは 一般的なライゲーションにしては妙に多いなというイメージはある これも使ってる試薬や過去例にもよるから確実じゃない てか今回の件のプレートがそのレベルの数だから ピックアップしにくいって話なら プレートに撒く直前の液をAmpLBかなにかで希釈して塗るだけで 37℃o/nのままの方がいいだろうし 基本に戻ってもう1晩使ってストリークして 元のインサートの影響を少なくするくらいかな

(無題) 削除/引用 No.12296-37 - 2024/05/02 (木) 21:51:27 - G25 わたしゃそういう時は、室温で放置です。 わざわざそれ用のインキュベータを設けるのもばからしいし

(無題) 削除/引用 No.12296-36 - 2024/05/02 (木) 21:33:28 - プリッツ G25さん ＞過去トピ参照 拝見させていただきました。 戻って形質転換からやり直す際には、低い温度で試してみます。 ちなみにGWさんが室温で土日をまたぐ際の手法を書いてくださったのですが、たとえば翌日にすぐ回収できる場合は、室温（25℃くらい？）では低すぎますか？ また実はO/N以上の時間培養してしまいそうになったことが過去にあり、その時に担当教員から25℃のインキュベーターに移すことを教えていただきました。その際に大腸菌を生やすには最初の温度が肝心で、まずは数時間37℃に入れておく必要があると教わったのですが、室温ないし30℃くらいで培養する際も、まずは37℃に入れておいたほうがよいでしょうか？ 知識不足で申し訳ありませんが、アドバイスいただけますでしょうか。

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