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(無題) 削除/引用 No.12292-8 - 2024/05/03 (金) 03:45:02 - おお >動物培養細胞の回収後ペレットが培地も無いし室温だし死細胞100％だろうからオートクレーブ滅菌しなくていいよねと言ったところで普通にゴミ出しして残培地からカビとか生えてくるの気持ち悪いじゃん。 気持ち悪い以上にウイルスなどがコンタミしている懸念はあるけどね。なのでUSではヒト細胞はBSL2ということになっています。日本はそこまで厳しくないという話も。

(無題) 削除/引用 No.12292-7 - 2024/04/26 (金) 19:01:43 - 念の為 学生ということで一応 原理的に不活化されてるのと そのまま捨てていいかは別だからね。 原則は研究室で決められたルールに従う。 温度湿度CO2で管理してやっと生きてる動物培養細胞の回収後ペレットが 培地も無いし室温だし死細胞100％だろうからオートクレーブ滅菌しなくていいよね と言ったところで普通にゴミ出しして残培地からカビとか生えてくるの気持ち悪いじゃん。 実験ゴミと加熱変形していないプラ包みが混在したゴミ袋は 本人は過程がわかってるからいいけど 責任者や処理業者から見ればオートクレーブ処理してないと分かる 監査かなにかで滅菌してないよね？って言われたら反論できない。 流しの先の下水処理や廃液タンク回収は学校・施設、廃棄業者によって違うから 例えばプラスミド精製の廃液は中和工程があるとはいえ 酸やアルカリにwash用エタノールが混ざってるからMIDIレベルの量の廃液を流せば 排水検査で引っかかる可能性もなくはない。 廃ゴミ用のオートクレーブがなくてチップ滅菌とかとかぶるとか 滅菌メンテナンスの為だけにエアシャワーの先の培養室内に行くのがめんどうとかでなければ １時間のオートクレーブくらいガンガンまわして 菌付着・菌付着疑いもまとめて不活化済み産廃ゴミとして出すのが無難

(無題) 削除/引用 No.12292-6 - 2024/04/26 (金) 15:32:29 - Sogomo みなさまありがとうございます。 確かにいつもDNA抽出するときは80℃で5分加熱するなどして、その後のTotal DNAサンプルは生きた菌などいない扱いにしていました。大腸菌ではないですが… 何度も高温になるサイクルですし、PCRの加熱処理後ならそれほど気にする必要もなさそうですね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12292-5 - 2024/04/26 (金) 11:41:27 - 774R 言われてみれば、プラスミド調製の時だって、申請書通りの不活化などしていなくて、アルカリSDSで死んだものとしてそのまま捨ててますね。 残渣ではないプラスミドDNA側だって、アルカリSDS後にアルコール（沈殿）処理してるけど、これも不活化の方法には記載せず、死んだものとして扱ってる。

(無題) 削除/引用 No.12292-4 - 2024/04/26 (金) 09:41:15 - 774 考えたことなかったですが、言われてみれば可能性としてはあり得ますね。 みなさんのご指摘のように、最初の95℃数分の処理で死んでしまいそうな気はしますが。 PCR後の溶液をLBプレートで培養したらわかるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12292-3 - 2024/04/25 (木) 19:28:40 - G25 食品衛生のほうの知識では、 病原性の大腸菌を含む、大腸菌群は75℃、1 minで死滅するというのが食中毒防止のガイドラインだそうで。 PCR,とくにcolony PCRでは95℃前後で数分のpre incubationをしますから（一つはhot-start タイプのポリメラーゼを目覚めさせるため、もうひとつは菌体を熱で破壊しDNAを放出させるため）、それで十分と考えます。これが枯草菌なんかだと不十分でしょうけど。 組換え生物の不活性化は、増殖、繁殖ができない状態にすることで、組換えDNAを破壊することは求められていないですから（オートクレーブをかけたって、組換えプラスミドは形質転換能を残している可能性大）。 それはそれとして、遺伝子組換え実験の申請の実験計画の「不活性化の方法」にオートクレーブとか次亜塩素酸処理なんて書くことがほとんどだけど、コロニーPCRを想定して「95℃、〇〇分以上の熱処理」というのも入れとかなきゃならないかな？　PCR産物を泳動するとかだけじゃなく外注でシークエンスにだすこともあるし。

(無題) 削除/引用 No.12292-2 - 2024/04/25 (木) 16:13:16 - おお 断言するのは避けたほうが良さそうですが、大腸菌内のゲノム（DNA)は９４度で変性するそうです。ゲノムのような巨大なDNAは変性してしまうと元には戻らないと言われているので、、、

コロニーPCRでは不活化処理が必要か 削除/引用 No.12292-1 - 2024/04/25 (木) 13:04:37 - Sogomo コロニーPCRを行いたいと考えている学生です。 方法はプロメガが公開しているGoTaq Green Master Mixを使った方法で行おうと思っています。 ここで疑問なのですが、PCRしたサンプルは不活化されていると考えても良いのでしょうか？PCRのサイクルによると95℃で加熱されるステップが何度かあります。 扱うものは遺伝子組換え細菌なので、普段は使用後の菌体はオートクレーブしているのですがこの場合はどうしたらいいでしょうか。 PCR産物をそのまま電気泳動した場合、ゲルや泳動槽が汚染される可能性はありますか？ 組換え体でコロニーPCRを行っているかた教えて下さい。

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