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(無題) 削除/引用 No.12286-8 - 2024/04/23 (火) 03:02:29 - 心配性 回答していただきありがとうございます。 原理に立ち返ってみればFlag-tagが解凍で外れることはないと理解できました。詳しく書いてくださりありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.12286-7 - 2024/04/23 (火) 02:58:28 - 心配性 >[Re:6] 独り言さんは書きました : > > > > > ビーズで処理後に冷凍保存すると、解凍した時にflag tagから外れてしまうという人の意見と、 > > > ここのステップの正確な意味がよく把握できないのですが、 > 普通、ビーズで処理とは、lysateとビーズをインキュベートした後に、ビーズをWashして、最後にSDSなどが入ったsample bufferでボイルしてから、SDS-PAGEしますよね。 > なので、通常はSample bufferでボイルした後のサンプルは、タンパク質間の結合もFlagタグからも乖離した状態のサンプルであり、この時点でタンパク質間の結合は気にせず―20度に保管できます。 > ビーズでwashした後に3xflag peptideを使って抽出する予定だったので、サンプルバッファーと混ぜてボイルする工程までやって冷凍することを考えていませんでした。。詳しい説明までしていただきありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.12286-6 - 2024/04/21 (日) 16:38:53 - 独り言 > > ビーズで処理後に冷凍保存すると、解凍した時にflag tagから外れてしまうという人の意見と、 ここのステップの正確な意味がよく把握できないのですが、 普通、ビーズで処理とは、lysateとビーズをインキュベートした後に、ビーズをWashして、最後にSDSなどが入ったsample bufferでボイルしてから、SDS-PAGEしますよね。 なので、通常はSample bufferでボイルした後のサンプルは、タンパク質間の結合もFlagタグからも乖離した状態のサンプルであり、この時点でタンパク質間の結合は気にせず―20度に保管できます。

(無題) 削除/引用 No.12286-5 - 2024/04/21 (日) 09:04:57 - おお >[Re:4] thyさんは書きました : > Co-IPしてbedsから溶出し、溶出物を−８０℃で保存してください。実験の原理を考えるとわかると思いますが、（low pHやSDS bufferなどの強い溶出条件では）溶出した時点、もしくはその後予定しているSDS-PAGEの時点でflag-tag proteinとそれと相互作用するパートナーの蛋白質との結合は解離するのですから、溶出物を凍結することで結合が外れてしまうことを危惧する人の考えている理由がちょっと分かりません。 激しく同意。ビーズをlysate に加えてビーズを回収して洗わずに凍結して、次融解した時に洗うというなら外れているかもしれませんが、普通洗ったあと凍結すると思う。

(無題) 削除/引用 No.12286-4 - 2024/04/21 (日) 08:43:32 - thy Co-IPしてbedsから溶出し、溶出物を−８０℃で保存してください。実験の原理を考えるとわかると思いますが、（low pHやSDS bufferなどの強い溶出条件では）溶出した時点、もしくはその後予定しているSDS-PAGEの時点でflag-tag proteinとそれと相互作用するパートナーの蛋白質との結合は解離するのですから、溶出物を凍結することで結合が外れてしまうことを危惧する人の考えている理由がちょっと分かりません。 IP後に溶出物を保存するほうが、精製していることで夾雑するプロテアーゼやホスファターゼの影響を受けるリスクも少ないと思いますし。 IP前の細胞、ライぜートの状態で凍結保存することは勧めません。保存中もしくは融解時に、ケースバイケースですが当該タンパク質の、不溶化、分解、あるいは複合体の解体などが起こる可能性があるようにおもいます。 ゲルがないとのことですが、通常、SDS-PAGEのゲルは安価な試薬で自分で簡単に作れると思うのですが、特殊な組成のゲルを必要とされているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12286-3 - 2024/04/21 (日) 06:30:47 - あの 目的とするタンパクによって、マチマチになりそうなら、考えられる全てのパターンで保存してみるのが良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.12286-2 - 2024/04/21 (日) 05:15:46 - おお 凍結保存、融解のプロセスで分解とか何らかの悪影響を気にするならIP（プルダウン）しておいて凍結すればベターかと思います。ただ、Lysatesの状態でディープフリーザーで保存することは多々あると思います。−２０度でLysatesを保存するならIP後のほうが安心です。IPしてサンプルバッファー中で保存すれば変性状態でプロテアーゼとか潜んでいてもかなりが失活しているでしょうし。

免疫沈降のためのタンパク質の冷凍保存 削除/引用 No.12286-1 - 2024/04/21 (日) 02:34:08 - 心配性 特定のタンパク質にFlag-tagをつけて、Co-IPでタンパク質同士のつながりがをみる実験をしようとしています。 HEK293Tからサンプルの準備ができそうなのですが、ちょうどゲルを切らしてしまいSDSPAGEがすぐにできません。サンプルを−２０度で冷凍保存しようと思うのですが、細胞からタンパク質を抽出後にすぐ冷凍保存したほうがいいのか、magnetic beadsで落としてからの方がいいのかアドバイスをもらえればと思います。 ビーズで処理後に冷凍保存すると、解凍した時にflag tagから外れてしまうという人の意見と、抽出後のものを冷凍し解凍すると見たいタンパク質同士の相互作用が壊れるという意見があり、決められないでいます。冷凍しないのが一番だと承知ですが、皆さんの経験などから一番いい方法を教えていただければと思います。

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