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(無題) 削除/引用 No.12281-8 - 2024/05/08 (水) 16:10:08 - G25 制限酵素消化したあとのプラスミドベクターのゲル電気泳動切り出し精製は、 省かないで絶対やったほうが良いです。 精製されたプラスミドには、アルカリ処理の副作用で部分変性して制限酵素で切れない分子が多かれ少なかれ混じっています。形質転換能は普通にあるので非組換え体のバックグラウンドを上げます。 難度の低いクローニングならバックグラウンドが多少高くても目的のものは取れますが、 サイズが大きいとかライゲーションしにくいとかで組換え体が出てきにくいクローニングでは、バックグラウンドを下げないと命取り。

初心者には難しいかも 削除/引用 No.12281-7 - 2024/05/08 (水) 11:06:23 - oyaji 初心者には難しいかも、、、。 ベクターが選択制の良いもの（bluewhiteなど）であれば、できると思います。 コツはDNAの量、酵素サイト、リガーゼ、コンピタント。 バックボーンのプラスミドサイズが大きく、サイトがブラントエンドとか、SalIとか、、、キレの悪いサイトがあると、難しい。

(無題) 削除/引用 No.12281-6 - 2024/05/03 (金) 23:35:49 - SYBR master >[Re:1] molecularさんは書きました : > 8kb のベクターに8kbのフラグメントをクローニングできるでしょうか。特別な方法、キット等がありましたらご教授ください。 他の方が書き込んでくれているように、別に問題のあるcloningでは無いです。少しサイズは大きいですが、ケミカルコンピでも出来ないサイズでは無いですし、不安ならG25さんが書いているようにエレポで入れれば大抵取れます。 ただ、これ大学に戻ってきてから感じたんですが、16K のベクターを制限酵素で切断して確認する場合、きちんと量比を考えて電気泳動した方が良いですよ。8K+8kなので、制限酵素で切断後、8K-5K-3K位で分離でき、且つそれぞれのバンドが明確に見える量を考えて泳動してみてください。 16Kが100 ng有っても、8K-5K-3Kの分離なら、8K=50 ng, 5K=31 ng, 3K=18.75 ngです。検出系によりますが、3 Kはかなり見にくくなりますので注意してください。3Kの部分が800 bp位なら、電気泳動では確認できない濃度(5 ng程度)になります。

(無題) 削除/引用 No.12281-5 - 2024/05/03 (金) 21:04:51 - G25 形質転換効率は、プラスミドサイズが大きくなるほど下がります。特に概ね10 kbを越えるあたりでガクッと一桁くらい下がります。ですから全てのステップで効率を下げないように配慮し、手抜き法は避けて基本に忠実に。 最もクリティカルなのはコンピーテントセルの性能で、高効率で新鮮なものを。できればエレポを使うのが理想的。

(無題) 削除/引用 No.12281-4 - 2024/04/19 (金) 12:09:38 - asan blunt　endでやらない限り言うほどハードルは高くなく、可能でしょう。 最近だとNEB builder（gibson assembly)とかリコンビナーぜを用いる方法でやれば簡単だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12281-3 - 2024/04/18 (木) 14:06:01 - おお 通常のLigationでもで可能な大きさではあります。難易度は上がると思いますが、丁寧にやればたいてい取れます。たまにLuciferase を使ったプロモーターのアッセイで１０kbpとか入れてるのを見ることがあります。２０kbpというのも一度あった。 そういうためのKitは知らないけど、工夫の余地はまあまああるのではと思います。例えば両端じゃなくて片方だけLigationが成立した状態なら、もう一方の末端からインバースPCR（実際には環状になってないのでインバースか怪しい）でつながった直鎖の１６kbpを作り環状化するとか。

(無題) 削除/引用 No.12281-2 - 2024/04/18 (木) 14:00:40 - えん 普通にできますよ。

cloning 削除/引用 No.12281-1 - 2024/04/18 (木) 13:26:04 - molecular 8kb のベクターに8kbのフラグメントをクローニングできるでしょうか。特別な方法、キット等がありましたらご教授ください。

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