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(無題) 削除/引用 No.12272-7 - 2024/04/19 (金) 03:26:55 - おお これも目的次第なんですが、複数プライマーを用意しているなら、Nestedで特異性を上げてみれば非特異なバンドや相同性がある他の遺伝子もいくらかは排除できると思います。そのうえで一度配列を読んでみてもいいのかもしれません。もちろんプライマーの位置によってあるアイソフォームがかからないとかいうこともあるわけですが。 また、RTをやり直してサンプリングでなにか起きてないかも見てなかったら一度確認されてみたらいいかもしれません。加えて非特異を拾いやすいという状況はRTのときにランダムプライマーやオリゴdTを使わずに、リバースプライマーでRTをすると改善する可能性が高いと思います。 発現が弱すぎるとノンスペが湧いてくるっていうこともありますね。こういうときはどうしたらいいんだろう。テンプレートの量を減らすとかでしょうかねぇ。プライマー次第でしょうけど。あとはPolyAで精製するか（mRNAとかPolyAテールがあるものなら）。

(無題) 削除/引用 No.12272-6 - 2024/04/17 (水) 19:11:20 - abs すみません、まちがえました。先程の-5の投稿は無視してください。

(無題) 削除/引用 No.12272-5 - 2024/04/17 (水) 19:09:34 - abs あるタンパク質を調べたくてその抗体で培養細胞の蛍光免疫染色したら固定方法（4%PFA室温10min or cold　MeOH −20℃5分)によって染まることろが異なります。金曜日に、PFA固定で染めたら細胞質が（核はほとんど染まらない）バシッと染まりました。で、月曜日、MeOH固定でやったらこれだとむしろ核（特に核小体）だけが明瞭に染まり、ああこれはもしか抗体間違えたかな？と思いもう一度同時にやったけど同様でした。なんか固定法が違うだけでこれ全然逆というかこれどっちが本当の姿なのよ、とか思い、文献とか抗体資料とか注意して見てたら強く染まるところがどれも少しずつ違います。どこが染まってもらっても私は別に構わないのですが、どれが本当の姿なのか知りたいです。PFA固定はあれだから気をつけろとかいう人もいるし、MeOH固定は結構やばい、とか、アセトン固定は裏切らないないとかいう話も聞きます。ていうか固定だけの違いでなんで局在がこれほどまでに変わるのでしょうか。 こういう蛋白質を経験したことありますか。原因とか知ってたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.12272-4 - 2024/04/17 (水) 10:39:51 - ゆう PCR様 ご回答ありがとうございます。 バンドの切り出し、シーケンスですか。新しいアイソフォーム同定できることも期待して一度してみたいと思います。 ありがとうございました。 おお様 ご回答ありがとうございます。 プライマーはいくつか検討したのですが、いずれもエクストラバンドが出てしまった状態です、、ただ一つだけ目的サイズの位置にバンドが見えたためPCR条件をいじってみようかと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12272-3 - 2024/04/13 (土) 03:15:22 - おお 指摘があるように、配列を読むまではアイソフォームなのかノンスペなのか判断は難しいですね。また、マウスなど実験動物やヒトのゲノム解析は進んでいるのでそういう細胞なら実際に存在するアイソフォームや可能性がある（予測された）アイソフォームを把握することができるので、それとも照らし合わせて考えてもいいでしょう。もちろんデーターベースが全てではない可能性は考えておくべきですが。 目的が何なのかよくわかりませんが、プライマーの設計し直し（データーベースなどを参考にして複数のバンドがでなさそうなところを探すとか）もありなのかもしれません。まあその前にアニーリング温度などいくつははPCRの条件をいじってみてもいいかもしれません。あるいは違うPCR酵素の商品を使うとか（意外とこれがノンスペ対策になったりもする）。 予測が難しいものでは（実際は予測する方法論はあるけど）変異などで通常のスプライシングが維持できなくなるとクリプティックなスプライシングサイトが使われて多数のバリアントが検出される場合です。ただそういうのはNMDで発現が弱くなっていることが多いのでバンドが薄くなっていたりサイクル数がそれなりに必要になったりすることもあります。だだ最近の酵素はrobustになってきているからなぁ

(無題) 削除/引用 No.12272-2 - 2024/04/13 (土) 00:18:07 - PCR 同様の経験あります。 >細胞Bではアイソフォームや相同配列を有するmRNAが複数存在し ている可能性があるとして、バンドを切り出してシークエンスにかけたら良いと思います。PCRに使ったプライマーでやるだけだから簡単です。 私はそれをやって、新規のAlternative spliced isoformを見つけた経験が2回、単にノンスペだった経験が多数、あります。 ノンスペだったら、仰る通りの 1)テンプレートDNAの量を減らす（半量から1/10位でもかかる場合多し） 2)アニーリング温度を上げる（現在の条件から+5C位まで条件を振ってみるとか） 等のPCRの標準的なトラブルシューティング方法を試したら良いと思います。

PCR後のエキストラバンド 削除/引用 No.12272-1 - 2024/04/12 (金) 22:12:58 - ゆう 細胞AとBからRNA抽出後、逆転写してcDNAを得ました。ある遺伝子に対する同じプライマーを使用し、PCR条件も同一にしてcDNAを増幅後、泳動しました。すると細胞Aは目的のサイズのみ特異的にバンドが確認されましたが、細胞Bではエクストラバンドが複数確認されました。 この場合、細胞Bではアイソフォームや相同配列を有するmRNAが複数存在していたと解釈してよいのでしょうか？ またこの細胞Bでも単一のバンドを得るためには、PCR条件の改善（アニーリング温度を上げるなど）でしょうか？ 他に考えられる原因や対策等ありましたら、ご教示頂けますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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