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(無題) 削除/引用 No.12271-7 - 2024/04/13 (土) 07:54:59 - PCR >>リバーストランスフェクション >これって毒性が的にはどうなんでしょうか。通常よりは強そうな気がします。 ttps://www.promega.com/resources/pubhub/reverse-transfection-using-fugene-6-and-fugene-hd/ カタログ的には、リバーストランスフェクションの方が毒性が強い場合もありますね。でも試薬によっては弱くなる場合もあるようだし、DNA量によってはほとんど差の無いところも多いし、スタンダードな方法かリバース方かは毒性的にはあまり問題にならないような気がします。 問題なのは発現量の方でしょうか。リバース方は発現弱いんですよね。 もっとも、発現させ過ぎても問題が起こることが多いし、HEK293を含むトランスフェクションが容易な細胞だとそれでも十分に発現することが多いので、私がやった実験系だとそれは特に問題になりませんでしたが。強発現が必須であればリバーストランスフェクションは選択しない方が良いでしょうね。 ttps://www.promega.com/resources/pubhub/tpub-205-choosing-the-right-transfection-reagent-for-optimal-efficiency/ カタログ上は、HEK293に対するViaFectの毒性は強くないようです。まあ、HEK293TとHEK293で違う可能性があるのは否定はしませんが、多分たいして変わらんのでは。

(無題) 削除/引用 No.12271-6 - 2024/04/13 (土) 03:01:03 - おお ちょっと実際に形態など見てみないとなんとも言えないですけど、トランスフェクション試薬で細胞が一部弱っているのでしょうか。 最近の導入試薬のプロトコールはDNAと試薬のコンプレックスを入れてそのまま放置するのがトレンドというか主流ですけど、もし細胞に何らかの影響がある場合はTransfectionしてから６から２４時間後に培地を交換するといいでしょう。昔のプロトコールはそうでした。 あとViaFectのマニュアルにはたしか、毒性が見られるときはDNA量を減らせと書いてあったかな。 >リバーストランスフェクション これって毒性が的にはどうなんでしょうか。通常よりは強そうな気がします。 drop-wise mannerが原因なら、Dishから培養液を一部取ってDNAーTF試薬のミックスに混ぜて戻してやればいいのかなとも思います。

(無題) 削除/引用 No.12271-5 - 2024/04/12 (金) 15:32:12 - ドロップ スタンダードなトランスフェクションプロトコールに従うと、トランスフェクション試薬+DNAの溶液をdropwise manner（って日本語でなんていうんでしょうか？極少量をピペットからポタッ、ポタッと落とすようなやり方）で細胞に加えると思います。が、HEK293Tは非常に剥がれやすく、このポタっと落ちたトランスフェクション溶液で細胞が剥がれたりすることがあります。 トランスフェクション試薬を加えた後に顕微鏡で細胞を観察されてはいますか？もしかしたら、ポタっと溶液が落ちたところに丸く穴が空いているかもしれません（でもserum入りの培地だと、翌日までにはその穴は塞がっているかも）。 もしこれが原因であればdropwise mannerで加えるのを止めるか、そこまで高いトランスフェクション効率を求めるのでなければリバーストランスフェクション(トランスフェクション試薬をプレートに加えてから細胞をまく方法）を試してみるのも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12271-4 - 2024/04/12 (金) 15:30:09 - toto viafectは、tfが難しい細胞でもよくはいるのですが、強い毒性が二日目くらいから出てきます。293Tだともっとマイルドな試薬か、PEIで十分に入りますよ。

(無題) 削除/引用 No.12271-3 - 2024/04/12 (金) 14:42:07 - あああ ありがとうございます。 試薬はPromegaのViafectを用いています。 やはり剥がれた細胞が塊状になったものであると考えるのが自然ですよね。。 試薬を減らして試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12271-2 - 2024/04/12 (金) 13:36:08 - ああああ リポフェクションと想像しますが、リポフェクション試薬には毒性があって、細胞が剥がれたり死んだりします。 ２９３Tは特に剝がれやすくなっていることが多いので、リポフェクション試薬を減らすか、死んだ細胞はそっとPBSで除いて接着している細胞だけで実験すると良いです。

HEK293Tの培養について（コンタミ？はがれて凝集している？） 削除/引用 No.12271-1 - 2024/04/12 (金) 13:18:42 - あああ 現在HEK293T細胞を取り扱っており、プラスミドをトランスフェクション試薬で導入しています。 その際の操作は、 1日目　細胞を6 or 24wellにまく 2日目　培地交換＋トランスフェクション 3日目　細胞をはがして回収 という手順で行っています。 この2日目のトランスフェクションの操作を行う前までは細胞は通常通りに接着して育っているように見えるのですが、トランスフェクション後の3日目に細胞を顕微鏡で見ると、丸い大きな塊がたくさん浮遊してしまいます。 これがコンタミなのか、また剥がれた細胞が塊状になっているものなのか、何か見識がある方がいらっしゃればお伺いしたいです。 なお、トランスフェクション試薬、プラスミドのみを培地に加えて一晩おいてみることもしましたが、特に何も増えなかったため、溶液そのものがコンタミしているとは考えにくいと思います。

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