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(無題) 削除/引用 No.12266-6 - 2024/04/14 (日) 18:54:46 - asan 1. Seqデータのばらつきの問題 　RNAseqデータの場合リード数やサンプルの質によってもノイズの入り方は異なるので、本当は個別サンプルできちんとノイズを処理する必要があります。DEGで処理する場合はまずはcount dataを確認してみることで、countが極端に低いデータはノイズが入るのでバッググラウンド処理をするのが一般的です。しかし、これを結構機械的にやってるとサンプルのノイズを拾ってる場合も多いです。例えば、TPMやFPKMはノーマライズされてしまってるのでデータのノイズを判断するのに向きません。scatter plotでcountを軸にとってdata1/2で展開した場合、countが一定値以下だと明らかにばらつきが大きくなるレベルがわかります。そこがあなたのデータでのノイズです。RNAseqデータのノイズレベルはリード数や出発サンプルのRNA量にも依存します。微量RNAを用いる方法だとノイズも増える傾向にありますが、通常の1000万-2000万リードであれば確実なのは20カウント前後でしょうか？　特に低い値はFold changeにした時に差となって大きく現れやすいので、注意が必要です。 2. サンプルそのもののノイズ 個体サンプルだと、ageや腹違いとかで結構差が出ることがあります。floxでCreで飛ばしてる場合だと全く同じジェノタイプのマウスでもたまに飛び効率が悪いマウスがいたりもします。N=2の場合それは顕著でしょう。RNAseqのデータそのものでポジコンやデータ全体の傾向はきちんとでてるのかは確認すべき。 3. primerの問題 RNAseqで検出したリードと、使用してるprimerの設計箇所の違いによって、RNAseqで検出したデータとことなるものを検出してる可能性はあります。プライマーの位置がバリアンとに乗ってたり特殊なものでないかは確認すべきです。その分子にこだわるのであればRNAseqで検出した場所をマッピングしてみるのも手です。

(無題) 削除/引用 No.12266-5 - 2024/04/12 (金) 02:06:11 - おお >[Re:4] ATGCさんは書きました : > > (1)定量PCRのReference geneの選定は？ > 定量PCRのReference geneとして使われる遺伝子は、十数種類はあります。 > たとえばRNAseqでの全個体のTPMの変動係数cv(標準偏差　わる　平均値)で比較した上で、一番変動係数が小さな遺伝子の相乗平均で補正しているでしょうか？ > →外注で出してもらった値で、具体的にどう補正したかは確認できていないです。確認します。 > 少なくともお使いのHprtとGapdhでRNAseqの発現量比較をして差がないかどうかまた、ばらつきがあるかどうかは確認できると思いますが。 qPCRのプライマーの位置などちょっと気になりますが。そのTranscriptsでRNAseqのカウントが比較的集中している部位があればそのあたりにプライマーを設定するというても取れそうな気がする。

(無題) 削除/引用 No.12266-4 - 2024/04/12 (金) 00:08:50 - ATGC すみません、お返事遅くなりました。 あの様、あああ様、コメントありがとうございます。 まだ確認が出来ていない点はありますが、返答します。 (1)定量PCRのReference geneの選定は？ 定量PCRのReference geneとして使われる遺伝子は、十数種類はあります。 たとえばRNAseqでの全個体のTPMの変動係数cv(標準偏差　わる　平均値)で比較した上で、一番変動係数が小さな遺伝子の相乗平均で補正しているでしょうか？ →外注で出してもらった値で、具体的にどう補正したかは確認できていないです。確認します。 (2)サンプルは本当に同一か？ 全血からとったRNAということですが、RNAseq用のロットと、定量PCR用のロットは完全に同一ですか？たとえば採血サンプルを分注していて、別々にRNA抽出したりcDNA合成したりしていませんか？ →血液で分注はしていないです。PAXgeneで回収し、RNAを抽出して、1つのチューブに保管。その一部をRNAseqに提出、残りでcDNA合成・定量PCRしています。 (3)発現量が多いか？ 調べたい遺伝子の発現量は多いですか？TPM値が少ないと、不一致しやすいような気がします。 →TPMを確認します。定量PCRではTarget遺伝子のCt値は24−28ぐらいはあり、定量PCRでは発現は十分ありそうです。

(無題) 削除/引用 No.12266-3 - 2024/04/10 (水) 02:42:58 - あああ あのさんが述べられていますが (3)発現量が多いか？ 調べたい遺伝子の発現量は多いですか？TPM値が少ないと、不一致しやすいような気がします。 自分も不一致についてたまに考えますが、上記の(3)が一番クリティカルな気がしています。

(無題) 削除/引用 No.12266-2 - 2024/04/09 (火) 21:13:11 - あの 参考になるかわかりませんが、次の3点が気になります。 (1)定量PCRのReference geneの選定は？ 定量PCRのReference geneとして使われる遺伝子は、十数種類はあります。 たとえばRNAseqでの全個体のTPMの変動係数cv(標準偏差　わる　平均値)で比較した上で、一番変動係数が小さな遺伝子の相乗平均で補正しているでしょうか？ (2)サンプルは本当に同一か？ 全血からとったRNAということですが、RNAseq用のロットと、定量PCR用のロットは完全に同一ですか？たとえば採血サンプルを分注していて、別々にRNA抽出したりcDNA合成したりしていませんか？ (3)発現量が多いか？ 調べたい遺伝子の発現量は多いですか？TPM値が少ないと、不一致しやすいような気がします。

RNAseqと定量PCRの結果の乖離 削除/引用 No.12266-1 - 2024/04/09 (火) 19:39:47 - ATGC よろしくお願いします。 野生型と変異マウスの全血由来(白血球由来)のRNAを用いて、遺伝子発現の比較をしています。 同じ時に回収した手持ちのRNAサンプルの内、一部のWT(n=2)と一部の変異マウス(n=2)のサンプルを用いて、まずRNAseqを行いました。結果、DEG解析で変異細胞で10倍程度に上昇している遺伝子を複数見つけました。 次に、保存していたWTと変異マウスの全血RNAサンプル(n=5とn=8)で定量PCRを行いました。 結果、RNAseqでみとめた遺伝子の発現亢進は確認出来ませんでした。 RNAseqで数倍〜10倍の違いのあった数遺伝子を検討しましたが、WTと変異マウスでほぼ差が無い結果です。 定量PCRのReference geneとしては、HprtとGapdhの2つで検証しましたが、結果は同じでした。 RNAseq用に抽出したサンプルでの異常値も疑いましたが、定量PCRの結果からは群内でのデータのバラツキは少なく、抽出したサンプルによる偏りでは無さそうです。 質問ですが、 RNAseqのデータはTMM補正したサンプルです。こういった補正の仕方で上がる下がるの結果が大きく変動することもあるのでしょうか。 その他、RNAseqのデータと定量PCRの結果に違いが出る理由としてどういったことが考えられますでしょうか。 よろしくお願いします。

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