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(無題) 削除/引用 No.12264-11 - 2024/04/10 (水) 08:47:43 - み IPの時に問題になるHeavy chain, Light chainとのバンドの重なりを問題にしているのではないと読んでいます。 野生型で検出される内在蛋白とtransgenicで外入れしたマウスで検出できる外来蛋白との間で発現量の差を見たいけどIP-Westernでの比較で良いのか？と聞いているのでは。 単純なWBで明確な差が出た方が良いと思います。 外入れの蛋白にタグは付いていないのかな。

(無題) 削除/引用 No.12264-10 - 2024/04/10 (水) 00:00:27 - LPS 同じ問題に遭遇したことがありますが、次のどれかの方法で解決しました。 １。一次抗体をビオチン化して、2次抗体の使用をしない。 ２。サンプルとプロテインG/Aビーズを反応させてその上清を使う。 いずれもうまくいきましたが、2の方が綺麗なことが多かったです。組織抽出液中に内在性のビオチンかタンパク質が存在するためでしょう。 まあ、これらの方法で、ターゲットと分子量的に被らない方法を選択です。 組織の前灌流は、ウエスタンの感度が高くて、どうしてもシグナルを拾ってしまうのと、そのレベルでは、灌流の効率を揃えるのが難しく断念しました。

(無題) 削除/引用 No.12264-9 - 2024/04/09 (火) 07:31:47 - おお IgGなど抗体はheavy chainが５０から７０kDa、Light chainが２０kDa強のところに出ます。IPしているなら抗体をゲルにコバレントに結合させていないならそのあたりにシグナルが見えているはずです。 組織の抗体が反応していないかどうかは、一次抗体抜きでWBの操作をするとほぼわかります。バンドが抗体のシグナルのサイズに近いなら一度確認しておくと良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12264-8 - 2024/04/08 (月) 18:49:11 - tred 返信ありがとうございます 臓器はそこまで血流豊富な組織ではなく、臓器特異的にターゲットタンパクが発現するよう遺伝子改変したマウスで、蛍光免疫染色で問題無く部位発現することは確認できています。 サンプルと一次抗体の動物種が同じだと特異性に問題があるのではないかと勝手に思い込んでいたのですが、皆さんのご助言で一般的には問題ないとわかり安心しました。

(無題) 削除/引用 No.12264-7 - 2024/04/08 (月) 16:50:59 - おお >[Re:1] tredさんは書きました : > しかし、HRPを用いたWBの定量比較となると感度が高いために有意差があったとしても同じ動物種ではどこまで正確性があるのか、論文の際にIPの画像定量だけでよいのか、WBをどこまで参考として扱っていいものか意見を頂きたいです。 > 蛍光免疫染色も 感度がどのように懸念なのかいまいちわからないけど、、、ノンスペの可能性を考えているのでしょうか。同じ動物種ならノンスペが出やすいと言うならその理屈もいまいちわからない。ノンスペの否定する方法はいくらかありますが、、、 組織の染色の方が定量が難しくなるし。

(無題) 削除/引用 No.12264-6 - 2024/04/08 (月) 13:43:21 - G25 何が問題ですか？ >しかし、HRPを用いたWBの定量比較となると感度が高いために有意差があったとしても同じ動物種ではどこまで正確性があるのか、 実際に起こっている問題ですか？ 確かに、酵素抗体法では酵素反応による増幅がリニアリティーが低下しがちですけど、 世の中的にはHRPの化学発光/発色で半定量的なデータにしてますでしょ。 「同じ動物種ではどこまで正確性があるか」とありますが、同種だと正確性に不安あって異種なら問題がないと考える理屈がよくわからないですが。 一般的には同種の一次抗体を使ったときの問題は、Anti-mouse Ig二次抗体が内在性のIgと反応するということだと思いますけど、そういう問題ではないのでしょうか？ IPにしてもWBにしても、標的タンパク質とIg（が変性した単鎖）の分子量が被らなければ問題ないし、非変性Igにしか反応しない二次抗体も利用できますよね。

(無題) 削除/引用 No.12264-5 - 2024/04/08 (月) 13:11:29 - おお IPの画像というのはCBB染色でしょうか。ならそちらの方が危ういと思う。マウスモノクロでマウスのタンパクを検出できるいい抗体は沢山あります。マウスが自己の抗体を作らないというのは正常動物個体レベルの話で、異所的な抗原に対しては自己のものでも反応します。

(無題) 削除/引用 No.12264-4 - 2024/04/08 (月) 08:45:29 - TS 他の方がおっしゃっているように、特殊な状況でなければ問題ないです。マウスのサンプルで、マウスモノクロがWBで一般的に使われるのと同様です。通常はないでしょうけど、もし二次抗体の交差が問題になるようなことなら、Trueblotのような未変性の抗体にのみを認識するものもあります。

(無題) 削除/引用 No.12264-3 - 2024/04/07 (日) 23:40:57 - 独り言 それは、血液の混ざっている組織なのでしょうか？ PBSで還流などして、IgGを除いていないということでしょうか？ 組織染色ならともかく、WBなら普通は問題なく使用できるようになるはずです。

(無題) 削除/引用 No.12264-2 - 2024/04/07 (日) 22:14:08 - qq >臓器から発現するように調整しており、 言っていることがピンときません。良ければ言い換えてみてください。 >同じ動物種ではどこまで正確性があるのか、 不安であれば他の動物でも確認されると良いですね。 試料中のマウス抗体を引っ掛けているのではないことは、別のマウス抗体（もしくは1次抗体なし）でも確認しているのですよね。 ウェスタンの定量にどの程度力点を置くかは、マウス・マウスとは別問題として出てきますが、ｔ検定で有意差があるとかないとか議論するのは無駄な気がします。

実験動物とWBの一次抗体の動物種が同一のものしか無い場合 削除/引用 No.12264-1 - 2024/04/07 (日) 19:35:42 - tred 基本的な質問で失礼します マウスの臓器を用いた実験をしております かなりマイナーなタンパクを臓器から発現するように調整しており、そのタンパクの一次抗体が実験動物と同じマウスモノクローナル(WB、IP可)しか販売されておらず、IPでは画像的にWTと比較して明らかに発現自体が確認できています。 しかし、HRPを用いたWBの定量比較となると感度が高いために有意差があったとしても同じ動物種ではどこまで正確性があるのか、論文の際にIPの画像定量だけでよいのか、WBをどこまで参考として扱っていいものか意見を頂きたいです。 蛍光免疫染色も考慮しましたが機械が故障し修理めどが無い状態です。 よろしくお願い申し上げます。

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