お世話になります。
すでに樹立されてるpcDNA3.1+ basedのプラスミドに、600 bp程度を挿入したいです。
そのため、in-fusionにて作ろうと思っています。
まず、pcDNA3.1+ basedのプラスミドをiPCRし、11,000 bpをPrime STAR Maxで増幅（20サイクル）させました。
その後続けてDpn処理し、ゲル抽（11,000 bpにバンドは見えていますが、それよりも上にスメアにも出ていました）を行い、11,000 bpバンドを精製をしました。（UV照射時間は2秒もないです）
次に600 bpを別のプラスミドを鋳型にPCRを行い（15サイクル）、続けてDpn処理し、ゲル抽を行い、精製をしました。
ゲル抽出は関東化学シカジーニアスキットを使用していまして、nano-dropでは検出限界以下でしたが、電気泳動ではきちんと検出されました。
iPCR産物 2 ul, PCR産物 2 ul, in-fusion Snap 1 ulを加え、50度、15分反応後、反応液全量を125 ulのXL-10 goldに加え、氷上20分、42度40秒、氷上3 分、その後、1 ml LBを加え、1時間37度で震盪培養しました。
その後、10000 rpm, 1 min遠心、上清を捨てたのち、50 ulで再度懸濁させた菌体をLB/Amp寒天培地にまきました。
コントロールとしては、in-fusion Snap 1 ulの代わりに水を1 ul加えた、5 ulを形質転換しました。
結果、それぞれから5コロニーほどが出る程度で、いずれもコロニーPCR陰性でした。
コロニーPCRの信用性はしばしば問題になりますが、今回、コロニー数が両プレートで変わらないことから、そもそもinfusionクローニングがうまくいっていないか、iPCRの量が少なすぎるのではと考えています。
そもそもiPCR直後にスメアになったのも不穏です。
infusionキットは購入したばかりですが使用経験はありません。
プライマーの設計は自動で作製したもので３度チェックを行い間違いはないことを確認しています。
これだえの情報ではなんとも言えないかもしれませんが、うまくいかないことはそんなにあるものでしょうか。ご助言いただけましたら幸いです。
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