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(無題) 削除/引用 No.12256-14 - 2024/04/06 (土) 02:46:55 - おお >[Re:12] あかりさんは書きました : > ＞おお様 > 　１．フラスコにMilliQ400mlいれる > 　２．93.06gのEDTA2Na・2H2Oをホットスターラーで少しずつ入れる。 > 　３．NaOH（固形）を約10g入れて溶かし、常温になるまで冷ます > 　４．pHを8.0に合わせる。 > 　５．オートクレーブする 10gNaOHが少ないのか多いのかよくわかりませんが、pH試験紙でだいだい７から８の間に収まるならそんなところかなと思います。 > > 　また、10×EDTA/PBSのレシピが分かりましたら教えていただけると幸いです。これは、下記計算式で出した量のEDTAと10×PBSの材料を一緒に混和すると作成できるでしょうか。 まあそれでいいけど、PBSでEDTAをいれる実験と入れない実験があるなら、１０xPBSを作っておいて希釈するときにEDTAを加えるほうがストックとしては使い勝手がいいのではと思ってしまう。１０xPBSと１０xPBS‐EDTAの両方のストックを持っているのはなんだかなぁって感じ。 > > 【計算式】 > 1000ml中に2%、つまり20gのEDTAが含有されて入れば良い。20gEDTAを得るために必要なEDTA2Na・2H2Oは(20/292.2438)×372.24≒25.47g > 24.47gのEDTA2Na・2H2Oを測り取り、800ml程度のDWを入れてNaOHでpHを調節しながら溶解する。全てとけたら1000mlまでメスアップする。 私のNo.12256-4のコメントで紹介したのは、EDTA４Naベースになってます。ま、大差はないかなと思いますが。一度培養の詳しい方法論などを書いたテキストを見るとスッキリするとは思いますが。。。さらにこんなのも。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.296.html

(無題) 削除/引用 No.12256-13 - 2024/04/05 (金) 18:22:49 - ねずみ こちらの情報も参考になるかもしれません。 http://life-science-project.com/616/ 0.5 M EDTAをPBSで1/1000希釈するとだいたい0.02%ということになります。 これくらいなら塩濃度やpHへの影響は無視できる程度だと思いますので、私だったら1xPBSに0.5 M EDTAを1/1000 vol. 加えて滅菌するだけで済ませます。

皆様コメントありがとうございます。 削除/引用 No.12256-12 - 2024/04/05 (金) 15:25:12 - あかり ＞おお様 　ありがとうございます。オリジナルレシピは以下の通りです。 　ご指摘の通り、4Naではなく2Naを使用しております。 　計算値が近く、私の計算も大きくは外れていないようで安心しました。 　１．フラスコにMilliQ400mlいれる 　２．93.06gのEDTA2Na・2H2Oをホットスターラーで少しずつ入れる。 　３．NaOH（固形）を約10g入れて溶かし、常温になるまで冷ます 　４．pHを8.0に合わせる。 　５．オートクレーブする 　また、10×EDTA/PBSのレシピが分かりましたら教えていただけると幸いです。これは、下記計算式で出した量のEDTAと10×PBSの材料を一緒に混和すると作成できるでしょうか。 【計算式】 1000ml中に2%、つまり20gのEDTAが含有されて入れば良い。20gEDTAを得るために必要なEDTA2Na・2H2Oは(20/292.2438)×372.24≒25.47g 24.47gのEDTA2Na・2H2Oを測り取り、800ml程度のDWを入れてNaOHでpHを調節しながら溶解する。全てとけたら1000mlまでメスアップする。 ＞イスパハン様 　ありがとうございます。EDTAはpHを調整しながら溶かしています。 ＞あの様 　ありがとうございます。培養する細胞によってEDTA濃度が違ったりしますので、できれ0.5Mから調節したいと思っています。 ＞ねずみ様 　ありがとうございます。私は、0.5MEDTA/PBSと10×トリプシンを使って0.05%トリプシン+0.02%EDTA/PBS溶液を調整したいと思っています。さらに行ってしまうと、0.2%EDTA/PBS溶液(要は10倍溶液）を作れたら簡単なのですが、計算に自信がなかったため質問させていただきました。 ＞vfgbh様 　レシピをありがとうございます。0.5MEDTAは同じように作っています。

(無題) 削除/引用 No.12256-11 - 2024/04/05 (金) 03:46:17 - おお 分子生物学などのプロトコール集でよく見るStock solutionは0.5M EDTAで２ナトEDTAをpHを８に合わせながら溶解していく作り方が推奨されてます。pHを合わせないと（低いと）溶けないです。 必要な溶液に加えるのが微量ならそのバッファー成分がEDTAに入ってなくとも影響がないですし、PBSに加えるとして、１０XPBSから作るなら最終濃度は保てます。

(無題) 削除/引用 No.12256-10 - 2024/04/04 (木) 12:49:18 - vfgbh 0.5M くらいの濃度のストック用のEDTA溶液を作り、これを必要量、PBSに希釈する。さらにトリプシンを加えて溶かし、最後に0.1μmのフィルターで滅菌する（0.1μmのフィルターなければ0.22μmでもいいけど0.1の方が良い）。 上記のストック用のEDTA溶液はEDTA2Naを水に混ぜてからNaOHでアルカリ性にして溶かし、完全に溶けたらHClでpHを中性付近に調整して作る。室温保存可能。

(無題) 削除/引用 No.12256-9 - 2024/04/04 (木) 10:15:32 - ねずみ あかりさん 間違っていたらすみません。実際にやりたいことはそれほど難しいことではなくて、手元にあるTrypsin/EDTAを、EDTAの濃度を変えずに希釈したいということではないですか？例えば手元に0.02% EDTA/0.1% Trypsin/PBSがあって、Trypsinを0.05%まで下げたい、とか。 私はTrypsin濃度を下げて使いたいときは単純にPBSで希釈しています。 ちなみに、メーカーによりますがTrypsin/EDTAに含まれるEDTAの濃度が1 mmol/Lと表記されているものもあります。参考まで。

(無題) 削除/引用 No.12256-8 - 2024/04/03 (水) 14:20:17 - おお >[Re:5] イスパハンさんは書きました : > そもそも、EDTAってPBSに0.5Mも溶けるっけ？ 全て粉を水に混ぜて、phを合わせたとかだと溶けるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12256-7 - 2024/04/03 (水) 14:06:55 - あの ちなみにPBS の10倍液を作れます(室温保存) 他にEdta液を使う予定が無いなら、10倍濃いEdtaPBSを作るという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.12256-6 - 2024/04/03 (水) 10:40:03 - おお >0.5M EDTAは [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂換算で 0.5M EDTAは [CH2N(CH2COOH)2]2;換算で

(無題) 削除/引用 No.12256-5 - 2024/04/03 (水) 09:59:10 - イスパハン そもそも、EDTAってPBSに0.5Mも溶けるっけ？

(無題) 削除/引用 No.12256-4 - 2024/04/03 (水) 02:27:53 - おお 0.5M EDTAは [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂換算で14.6% (wt/vol)なので 14.6/0.02 倍希釈、すなわち730倍希釈です。50mlに730倍希釈になるように加えるなら、50/730 ml 加えればいいので計算すると0.068 mlすなわち68マイクロLが50 mlに含まれる計算になります。容量的には微量なので、0.05% /PBS、50 mlに68マイクロL加えても構いません。 ただ、0.02% EDTAといってもラボでよく扱うのは、２ナトリウムで、２ナトリウムを0.02%加えている可能性もなくはない。オリジナルのレシピを確認したいところ。実験によってはどっちでもあまり違いはないと思うけど。 とおもってぐぐったら、 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t4049 EDTA 4Naベースで0.02％になってるね。なので上記に沿って計算し直すといいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12256-3 - 2024/04/03 (水) 01:36:18 - あかり >[Re:2] 絵drftgyふさんは書きました : > EDTAをPBSに溶かしてフィルター滅菌して作れば良いのではないでしょうか。 ありがとうございます。もちろん、EDTA作成後はオートクレーブ滅菌しております。そこは大丈夫なのですが、濃度計算が不安なのです。

(無題) 削除/引用 No.12256-2 - 2024/04/02 (火) 22:54:34 - 絵drftgyふ EDTAをPBSに溶かしてフィルター滅菌して作れば良いのではないでしょうか。

0.5M EDTA/PBSを0.02%にする方法 削除/引用 No.12256-1 - 2024/04/02 (火) 19:23:57 - あかり 初歩中の初歩な質問で申し訳ありません。 0.5M EDTA/PBSを使って50mlの0.05%トリプシン+02%EDTA/PBS溶液を作りたいと思っています。以下のように計算したのですが、合っているでしょうか。 【計算式】 50ml×0.02/100＝0.01　(0.01/292.2438)/0.5=6.8436....×10^5→68.4µl よって68.4µlの0.5M EDTA/PBSを50mlにメスアップすると0.02% EDTA　 ちなみに、2%EDTA溶液をEDTA2Na・2H2Oで作ろうと思ったら、以下のようにつくったら良いでしょうか。 【計算式】 1000ml中に2%、つまり20gのEDTAが含有されて入れば良い。20gEDTAを得るために必要なEDTA2Na・2H2Oは(20/292.2438)×372.24≒25.47g 24.47gのEDTA2Na・2H2Oを測り取り、800ml程度のDWを入れてNaOHでpHを調節しながら溶解する。全てとけたら1000mlまでメスアップする。 Webサイトを調べたものの、2%EDTAのレシピは特に掲載されておらず、計算が正しいのか自信がなかったので、教えていただければ幸いです。

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