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オルガノイドでのマトリゲルの使用方法について トピック削除
No.12255-TOPIC - 2024/04/02 (火) 18:43:11 - IK
いつも勉強させていただいております。
現在オルガノイドの作成に、マトリゲルGFRを用いたサンドイッチ法 (オーバーレイ法)で実験をしておりますが、均一な厚みのマトリゲル層を作成するのに苦戦しております。

具体的には24well plateを事前に冷蔵庫で冷やし、氷上にplateをおいて各wellにマトリゲル原液100μlを冷却したチップでいれ、well全体に行き渡らせてから37℃のインキュベーターにいれて30分間重合しています。そうした場合マトリゲルがwellの外側にかたよってしまい、中央部分ではオルガノイドが形成されませんでした。200μl程度applyすると中央部分もオルガノイドが形成されたのですが、今度は厚くなりすぎた外周部分のオルガノイドが極端に成長が早くなるといった事象がおきています。培地を用いてマトリゲルを50%に希釈して粘稠度をさげてみたのですが、中央に厚みをもたせようと全体量を増やすと外周に厚みができすぎ、やはりオルガノイド成長速度に差が大きくでてしまっています。
表面張力によってwellの外側と内側のマトリゲルの厚みに差がでてしまうことに対して、何らかの工夫ができればと考えております。
皆様よい知恵がありましたら、ご教授いただけますと幸いです。
何卒よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.12255-5 - 2024/04/13 (土) 21:52:12 - IK
皆さんご助言ありがとうございました。
遠心に関してはより外周の層が増えてしまいました。
non-coatingのプレートにしたところ、やや外周の厚みが減りましたので、non-coatingのプレートで続けてみたいと思います。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.12255-4 - 2024/04/03 (水) 03:21:51 - おお
https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/105707/Eppendorf_Consumables_Application-Note_330_Cell-Culture-Consumables_Improved-optical-performance-facilitates-microscopic-analysis-cells.pdf

https://www.stemcell.com/smartdish.html

そういう商品も出回ってはいますね。24well plateフォーマットのものも見つかるだろうか。

(無題) 削除/引用
No.12255-3 - 2024/04/03 (水) 03:15:07 - おお
https://ibidi.com/content/801-how-can-the-meniscus-be-minimized

Tissue culture treatedのプレートは親水性がましているので、質問のような現象が顕著に現れるようです。Tissue culture treatedでないプレートのほうがWellの壁の部分が疎水性でありいくらか増しになるような事が以下のURLに書かれてます。

内径にちょうどフィットするシリコンラバー見たいのをはめ込んで、あるところ以上は水位が上がらないようにするような方法もなくはなさそうですが、、、

(無題) 削除/引用
No.12255-2 - 2024/04/03 (水) 02:54:34 - あの
自分ではやったことが無いので、いい加減な話として聞いてください。

どうしても表面張力の影響を無くしたいなら、何らかの物理的な力を加える必要がありそうですね。

一瞬、プレート遠心機はどうかなと思いましたが、たぶんダメでしょうね。

逆の発想(？)で、使いたく無いところを、滅菌したメス刃とかで、削りとってしまうのはダメですか？めんどくさいのと、有効部分が狭くなる欠点があるけど。

オルガノイドでのマトリゲルの使用方法について 削除/引用
No.12255-1 - 2024/04/02 (火) 18:43:11 - IK
いつも勉強させていただいております。
現在オルガノイドの作成に、マトリゲルGFRを用いたサンドイッチ法 (オーバーレイ法)で実験をしておりますが、均一な厚みのマトリゲル層を作成するのに苦戦しております。

具体的には24well plateを事前に冷蔵庫で冷やし、氷上にplateをおいて各wellにマトリゲル原液100μlを冷却したチップでいれ、well全体に行き渡らせてから37℃のインキュベーターにいれて30分間重合しています。そうした場合マトリゲルがwellの外側にかたよってしまい、中央部分ではオルガノイドが形成されませんでした。200μl程度applyすると中央部分もオルガノイドが形成されたのですが、今度は厚くなりすぎた外周部分のオルガノイドが極端に成長が早くなるといった事象がおきています。培地を用いてマトリゲルを50%に希釈して粘稠度をさげてみたのですが、中央に厚みをもたせようと全体量を増やすと外周に厚みができすぎ、やはりオルガノイド成長速度に差が大きくでてしまっています。
表面張力によってwellの外側と内側のマトリゲルの厚みに差がでてしまうことに対して、何らかの工夫ができればと考えております。
皆様よい知恵がありましたら、ご教授いただけますと幸いです。
何卒よろしくお願いいたします。
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