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(無題) 削除/引用 No.12241-14 - 2024/03/28 (木) 23:56:34 - モンテディオ山形 SYBR+masterさん ご指摘ありがとうございます。 ご指摘いただいたのを踏まえて、再度プロトコルを練り直します。

(無題) 削除/引用 No.12241-13 - 2024/03/28 (木) 23:07:15 - SYBR+master >[Re:12] モンテディオ山形さんは書きました : > ここに一番原因があるかもしれないです。 > 何回か同じ濃度で試しているのですが、Teer値がさほど変わらない場合でも結果にばらつくのかもしれません。 「Teer値」ってすごい狭い範囲の分野でしか使われていない言葉なので、それ自体を使う場合、一般的な用語のフルネームを出してからでないと、何の意味かがわかりません。使用には気を付けてくださった方が良いです。 > 今回扱っているポリフェノールは配糖体を持っておりますが、水には溶けにくい性質を持っており、過去のvitroの条件を参考にDMSOで溶解しました。 では僕の記憶に無い「ポリフェノール」類だったとして、それが配糖体だとしても水に可溶性が低いのだったとしたら、私が示した、最初の例でdDw一気に希釈する以外の方法は無いです。3回も希釈するなんて論外です。

(無題) 削除/引用 No.12241-12 - 2024/03/28 (木) 22:44:36 - モンテディオ山形 SYBR masterさん ＞水に難溶性な物は、水系のbufferで希釈したつもりでも、全く希釈が出来てい＞なくて濃度にバラツキが出ます。それを3回も繰り返したなら、その希釈その＞ものに再現性が無いです。 ここに一番原因があるかもしれないです。 何回か同じ濃度で試しているのですが、Teer値がさほど変わらない場合でも結果にばらつくのかもしれません。 ＞フラボノイド系は基本、配糖体化すると水溶性になるけど、なんでDMSOに溶か＞したの？ 今回扱っているポリフェノールは配糖体を持っておりますが、水には溶けにくい性質を持っており、過去のvitroの条件を参考にDMSOで溶解しました。

(無題) 削除/引用 No.12241-11 - 2024/03/28 (木) 21:42:49 - SYBR master >[Re:10] モンテディオ山形さんは書きました : > 濃度勾配が緩やかになる理由がイメージできません。 > 現在は、10倍希釈を3回繰り返しております。 水に難溶性な物は、水系のbufferで希釈したつもりでも、全く希釈が出来ていなくて濃度にバラツキが出ます。それを3回も繰り返したなら、その希釈そのものに再現性が無いです。 > 0.22um以下のフィルターでろ過する理由もご教授して頂けると幸いです。 えーっと、そこからなのか。「滅菌のため」です。滅菌がフィルターで出来る理由は、目の前のPCやスマホで調べてください。 > 例えば配糖体が外れる可能性があるとか。 え、配糖体なの？なら水溶性では無いの?個人的な記憶としては、「ポリフェノール」のたぐいで、配糖体なら「フラボノイド系」で、配糖体化したそいつらほぼ水溶性なんだけど。アントシアニンはアントシアニジンの配糖体で、水溶性だけど。フラボノイド系は基本、配糖体化すると水溶性になるけど、なんでDMSOに溶かしたの？アントシアニンが水溶性なのは、ツユクサの「青花紙」で検索してみてください。 ちなみに「フラボノイド系」なら、熱かけなくても、空気中の酸素と反応してすぐに酸化して赤色を呈します(リンゴの切断面が酸化して赤黒くなるのがそれです)。これは、アグリコンでも配糖体(厳密には配糖体は酸化されにくくは成っています。糖鎖が酸化されやすい部分を守ると考えられているので)でもあまり変わらないです。また逆に、「配糖体」化されて無いものは殆ど水には溶けません。

(無題) 削除/引用 No.12241-10 - 2024/03/28 (木) 20:16:21 - モンテディオ山形 現在ポリフェノールはDMSOで溶かしております。 そしてBufferで希釈しています。 ＞完全溶解できる溶媒(ポリフェノール類なら脂質か純エタノールですが、こ＞の場合エタノールが良いかと)で溶解したあとで、必要量を最終濃度に見合＞う量で、溶媒(この場合、目的bufferで)で一気に希釈します。そうすると濃＞度勾配等は緩和されます。高濃度buffer中(10×)に必要量加えて、dDWで希＞釈でも良いですがこの場合最終液量が1L位が目安だったと記憶しています。＞希釈するときに「ためらう」と濃度に勾配が出来やすいです。（すいませ ＞ん、ここらへん上手く説明できて無いのはよく解っています)。大昔、植物＞で培養するときに水に溶けない(難溶ではなく不溶に近いもの)を、培養液に＞ppmレベルで加えるときに使っていた方法です。 すいません。 濃度勾配が緩やかになる理由がイメージできません。 現在は、10倍希釈を3回繰り返しております。 ＞また、オートクレーブ不可な物なら、これを培養細胞等に添加する場合は、＞0.22um以下のフィルター濾過で滅菌してください。 0.22um以下のフィルターでろ過する理由もご教授して頂けると幸いです。 ＞なるほど。なら透過試験中の酸化がばらつきの要因だったりもするのか＞ ＞な、、、 ＞それと３７度でしばらくインキュベーションというのも酸化するなら良くな＞いですかね、、、 ＞微量の抗酸化剤とか溶かすときやインキュベーションするとき入れておけば＞いいのかなって気もしてきた。 酸化というより、分解される可能性はありますでしょうか。 例えば配糖体が外れる可能性があるとか。

(無題) 削除/引用 No.12241-9 - 2024/03/28 (木) 01:49:55 - おお >あと、「ポリフェノール類」等は非常に酸化しやすいので、 なるほど。なら透過試験中の酸化がばらつきの要因だったりもするのかな、、、 それと３７度でしばらくインキュベーションというのも酸化するなら良くないですかね、、、 微量の抗酸化剤とか溶かすときやインキュベーションするとき入れておけばいいのかなって気もしてきた。 また、Tweenとかぐらいなら微量入っていても培養ではさほど影響がないようなのでそういったものも溶かすときに使えるかも。

(無題) 削除/引用 No.12241-8 - 2024/03/27 (水) 22:22:36 - SYBR master >[Re:5] モンテディオ山形さんは書きました : > サンプルは、水溶性が低いサンプルになります。 > 主にポリフェノール類が含まれているサンプルです。 水溶性の低い試薬に対しては、それを含む試薬の作り方を知っていないと、結果がばらつくのは、化学系に近い分野なら知っているんですけど、純粋生物系 なら知らないかもしれませんね。 完全溶解できる溶媒(ポリフェノール類なら脂質か純エタノールですが、この場合エタノールが良いかと)で溶解したあとで、必要量を最終濃度に見合う量で、溶媒(この場合、目的bufferで)で一気に希釈します。そうすると濃度勾配等は緩和されます。高濃度buffer中(10×)に必要量加えて、dDWで希釈でも良いですがこの場合最終液量が1L位が目安だったと記憶しています。希釈するときに「ためらう」と濃度に勾配が出来やすいです。（すいません、ここらへん上手く説明できて無いのはよく解っています)。大昔、植物で培養するときに水に溶けない(難溶ではなく不溶に近いもの)を、培養液にppmレベルで加えるときに使っていた方法です。 また、オートクレーブ不可な物なら、これを培養細胞等に添加する場合は、0.22um以下のフィルター濾過で滅菌してください。「ポリフェノール類」がオートクレーブかけれるかどうかは知らないです。 あと、「ポリフェノール類」等は非常に酸化しやすいので、用事調製の方が良いと思います。用事調整が難しいなら、bufferやdDWを脱気(脱酸素)しておくのも一つの手ですが、基本用事調製の方が結果は安定すると思います。 ただ、Caco-2に取り込ませたいなら、「ポリフェノール類」は脂質に溶かしたほうが吸収は良いかもしれない(たしか10倍くらい違いが出たはず)なので、結果は安定はしないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12241-7 - 2024/03/27 (水) 10:45:20 - モンテディオ山形 おおさん 名前大変失礼しました。 ＞それなら３７度で２４時間（でしたっけ）Incubationというのは完全に溶解す＞るためということでしょうかね。分解等のおそれがなければやったほうがいい＞のかもしれません。溶解が不完全で凝集体が残っているなら、透過しにくい分＞子も混在しているということなので。 ファーストチョイスとしてこれをまず検討したいと思います。 ＞また、そのサンプルが細胞内に入ったりしたときに細胞の状態を変化させてい＞る可能性がないですかね。。。それなら少し低濃度にしてみるのも手かもしれ＞ませんね。 細胞内に取り込まれている可能性もありますね。 実際に細胞回収して細胞内のサンプルの定量も考えております。 低濃度に関しては、透過量算出に必要なピークを検出できるかどうかもありますので、10倍希釈した場合も想定しておきます。

(無題) 削除/引用 No.12241-6 - 2024/03/27 (水) 02:57:57 - おお >[Re:5] モンテディオ山形さんは書きました : > あおさん > > ご教授ありがとうございます。 > サンプルは、水溶性が低いサンプルになります。 おおです。 それなら３７度で２４時間（でしたっけ）Incubationというのは完全に溶解するためということでしょうかね。分解等のおそれがなければやったほうがいいのかもしれません。溶解が不完全で凝集体が残っているなら、透過しにくい分子も混在しているということなので。 また、そのサンプルが細胞内に入ったりしたときに細胞の状態を変化させている可能性がないですかね。。。それなら少し低濃度にしてみるのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12241-5 - 2024/03/26 (火) 14:06:25 - モンテディオ山形 あおさん ご教授ありがとうございます。 サンプルは、水溶性が低いサンプルになります。 主にポリフェノール類が含まれているサンプルです。

(無題) 削除/引用 No.12241-4 - 2024/03/26 (火) 01:24:36 - おお >[Re:3] おおさんは書きました : > ちなみにコントロール群はばらつかないのですか？ あ、コントロールがどうこうという実験系ではないですね、何かとの比較ということでない限り、、すいません。

(無題) 削除/引用 No.12241-3 - 2024/03/26 (火) 00:39:35 - おお ちなみにコントロール群はばらつかないのですか？

(無題) 削除/引用 No.12241-2 - 2024/03/26 (火) 00:31:44 - おお >�A サンプルに問題があり→37℃24時間インキュベーションをしていないので、この工程を追加して、遠心して上清を回収する。 それはサンプルによるだろうし、質問を見ただけでは判断できない。アミロイドなどオリゴマーを生成させるためにそういう作業をすることはある。この場合購入した試料がモノマーであること（そうでなければ一度モノマーになるように処理を施す）、そのモノマーから活性のある（なん分子でオリゴマーを形成しているかなど）オリゴマーを作るといった作業がいる場合があります。

in vitroの結果がばらつく理由 削除/引用 No.12241-1 - 2024/03/25 (月) 10:00:06 - モンテディオ山形 Caco-2細胞で透過試験をおこなっておりますが、サンプル間でばらつきが生じてしまいます。 考えられる原因としては、 �@ Bufffer溶液→3か月前に調製した液体なので、新しいのを作り直す。 �A サンプルに問題があり→37℃24時間インキュベーションをしていないので、この工程を追加して、遠心して上清を回収する。 �B 細胞の状態が悪い→Teer値にサンプル間でそこまで誤差がないので原因としては低いかなと。 他に経験則的に何かあればご教授いただければ幸いです。

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