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(無題) 削除/引用 No.12227-5 - 2024/03/20 (水) 03:06:27 - おお >[Re:4] YYYさんは書きました : > ブロッキングは3%スキムミルクです...ロッキングしてるから全面青くなるかなあと思ったのですが、なりませんでした。使用してるのはPVDF膜ですので、ニトロセルロース膜の場合はもともとCBB染色できないのでどうなるかわかりません。 ニトロセルロースは駄目ですね。ニトロセルロースへのCBBの吸着力が強すぎるので。Colloidal CBBならマシという話も聞いたことがありますが、やったこともないので。。。またニトロセルロースは酢酸が多いと溶け出してきたりして膜が歪みだします。 質問での方法、やっている人がいました。ブロッキングはスキムミルクを使っていたと思います。意外とワークするんだなと思ったことがあります。抗体の県に関しては微量なのでCBB染色で差が出るほどではないと私も思います。自身が使っている抗体濃度とか確認すればいいかと思います。また経験上抗体反応液は数回使い回しができることから、特異的だからといって加えた抗体が全部ついているわけではないでしょう。CBB染色のときに抗体も変性するだろうから（高濃度メタノールと酢酸）、抗原を認識できなくなっていると思いますので、剥がれていっている可能性もあるかもしれません（逆に吸着してしまっていると指摘されれば反論材料はありませんけど）。

(無題) 削除/引用 No.12227-4 - 2024/03/20 (水) 00:00:35 - YYY ブロッキングは3%スキムミルクです。バックグラウンドはごく薄い青ですが、ある程度脱色を進めれば、タンパク質バンドは脱色されることなく、乾燥後はバックはほとんど白くなります。なのでS/N比は良くなりマイナーバンドも見えてきます。昔、このようなやり方を始める前はブロッキングしてるから全面青くなるかなあと思ったのですが、なりませんでした。ブロッキングのタンパク質はTBS/PBSの洗浄中にかなり容易に取れるみたいです。使用してるのはPVDF膜ですので、ニトロセルロース膜の場合はもともとCBB染色できないのでどうなるかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.12227-3 - 2024/03/16 (土) 14:59:15 - あの 念のためですが、ブロッキング剤は、非タンパクですね？

(無題) 削除/引用 No.12227-2 - 2024/03/16 (土) 14:56:07 - や いやそこまでは見えないと思います。 抗体の濃度を1-5 ug/mlでやるとして、その数％しか結合していないと思います。 だとすれば、CBBの検出限界以下になると思いますよ。

PVDF膜のタンパク質染色 削除/引用 No.12227-1 - 2024/03/16 (土) 14:05:54 - YYY Westen blottingして抗体反応から検出まで全部終えてから、最後にmembraneをタンパク質染色する場合、抗体は除去してから染めますか？除去しないと、抗体が結合してる部分はその分だけ本来の染色強度よりも濃くなりますか？なんとなくそのように見える気がして。

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