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酵母でhomologous recombinationでプラスミド構築 トピック削除
No.12226-TOPIC - 2024/03/15 (金) 20:08:45 - 酵母
酵母発現プラスミドライブラリーを構築中です。
相同配列のあるinsertとプラスミドを酵母にエレポすると、
homologous recombinationによって融合し、そのまま酵母がこのプラスミドを発現するという論文を良くみますが、
このhomologous recombinationに関して質問です。

例えば次のようなBamHIを含むプラスミド配列があったとします。

5'-aaaaaaaaaaaaaaa-BamHI-ggggggggggggggggg

実際にはこのような配列ではないですが分かりやすくするために
aaaaa, gggggと書いてます。
これをBamHIで切ると

5'-aaaaaaaaaaaaaaa-G
3'-ttttttttttttttt-CCTAG

という断片が出来ます。
homologous recombinationは30~40塩基の相同配列が必要です。

第一の質問です。homologous recombinationを起こす際に
CCTAGという突出末端を相同配列としてカウントして良いか？

第二の質問です。
インサートを
5'-aaaaaaaaaaaaaaa-CCCCCCCCCCCC (CCCC...はインサートの配列)
とした場合、プラスミドの末端はGのためミスマッチとなりますが、
最終的なインサートが挿入されたプラスミドはGが除去されて
5'-aaaaaaaaaaaaaaa-CCCCCCCCCCCC
という配列になるのでしょうか。

ご教授いただけますと幸甚です。
どうぞよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.12226-4 - 2024/03/19 (火) 13:58:47 - 酵母
egeria様

完璧なご回答をしてくださり感謝申し上げます。
その上、非常に役立つ情報まで追記してくださり有難うございます。
早速ご助言頂いた方法を試してみたいと思います。
有難うございました。

(無題) 削除/引用
No.12226-3 - 2024/03/18 (月) 12:30:17 - egeria
酵母の相同組換えの過程ではDNAが部分的に一本鎖化されるのですが、その際には5'-3'エキソヌクレアーゼが働くので、この例のような5'突出部分は削られてしまい、カウントできないと考えられます。ただし、通常はプライマー等で40塩基以上の相同領域を確保するのが定石であり、そのようなデザインでは数塩基の違いは結果に大きく影響しないと思います。

第二の質問については、おっしゃるように相同領域より末端側は除去されるという理解で合っています。

質問の趣旨からは外れますが、少なくともS. cerevisiaeの場合、リニアプラスミドを細胞内で環状化するという活性があり、未消化プラスミドをどれだけ減らしても空ベクターコロニーが一定程度出現します。自己環状化の頻度はcompatible cohesive end >> blunt end > incompatible cohesive endとなっているので、可能であれば異なる2種類の制限酵素で切断するか、平滑末端となる酵素を使うことをおすすめします。バックボーンに変異が入る可能性を許容できるなら、ベクターをPCRで増幅してDpnI処理するのが最もバックグラウンドが低くなります。

どうしてもBamHIしか使えず、空ベクターコロニーが実験に支障をきたすほど多い場合（酵素によっても環状化の頻度が異なります）、切断産物をTaq系のポリメラーゼでしばらく処理して両末端を3'A突出に変換すると、自己環状化をかなり減らすことができると思います。BamHIでやったことはありませんが、他の酵素で同様の事例があったときに成功しています。

(無題) 削除/引用
No.12226-2 - 2024/03/16 (土) 00:56:56 - おお
ちょっとなにいっているかわかりませんが、、、
相同性のある部分の外側に余分な配列があっても大丈夫ですが、その部分は無視されるはずです。

2つ目の質問は3‘のアームがないけど、、、gもないしどうなってんの？

酵母でhomologous recombinationでプラスミド構築 削除/引用
No.12226-1 - 2024/03/15 (金) 20:08:45 - 酵母
酵母発現プラスミドライブラリーを構築中です。
相同配列のあるinsertとプラスミドを酵母にエレポすると、
homologous recombinationによって融合し、そのまま酵母がこのプラスミドを発現するという論文を良くみますが、
このhomologous recombinationに関して質問です。

例えば次のようなBamHIを含むプラスミド配列があったとします。

5'-aaaaaaaaaaaaaaa-BamHI-ggggggggggggggggg

実際にはこのような配列ではないですが分かりやすくするために
aaaaa, gggggと書いてます。
これをBamHIで切ると

5'-aaaaaaaaaaaaaaa-G
3'-ttttttttttttttt-CCTAG

という断片が出来ます。
homologous recombinationは30~40塩基の相同配列が必要です。

第一の質問です。homologous recombinationを起こす際に
CCTAGという突出末端を相同配列としてカウントして良いか？

第二の質問です。
インサートを
5'-aaaaaaaaaaaaaaa-CCCCCCCCCCCC (CCCC...はインサートの配列)
とした場合、プラスミドの末端はGのためミスマッチとなりますが、
最終的なインサートが挿入されたプラスミドはGが除去されて
5'-aaaaaaaaaaaaaaa-CCCCCCCCCCCC
という配列になるのでしょうか。

ご教授いただけますと幸甚です。
どうぞよろしくお願いいたします。
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