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(無題) 削除/引用 No.12223-13 - 2024/03/21 (木) 12:46:15 - N 皆様 自作ゲルについては、試薬類を全部作り直したら適当な泳動像になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12223-12 - 2024/03/16 (土) 15:49:31 - おお >[Re:11] Kさんは書きました : > 10KDa前後もしくはそれ以下の小さいタンパク質/ペプチドの場合、移動度にSDSの付き方とかアミノ酸組成の影響がしばしば強く現れるため、電気泳動上の見かけの分子量が理論値の分子量とは必ずしも一致しない（時にはかなり違う）ことがよくあります そうなのよ。それも書いたほうがいいなとおもいつつも、、、質問されている方の場合マーカーはどうなんでしょうかね？マーカーは一応１５％もあれば１０kDaのマーカーなら分離していると思う。

(無題) 削除/引用 No.12223-11 - 2024/03/16 (土) 10:36:30 - K Tris-Trycine系ゲルは市販品もありますね。頻回行うのでないなら、買った方が得策かもしれないですね。 10KDa前後もしくはそれ以下の小さいタンパク質/ペプチドの場合、移動度にSDSの付き方とかアミノ酸組成の影響がしばしば強く現れるため、電気泳動上の見かけの分子量が理論値の分子量とは必ずしも一致しない（時にはかなり違う）ことがよくありますので注意してください。10KDa以下は電気泳動の示す分子量はあまりあてにならないと思った方がいいです。 またwestern blottingで見る場合は10K Daくらいだと、一般的に使われている0.45μmのポアサイズのPVDF膜だと、ペプチドを膜に保持できず、もしかするとうまく転写できない可能性が危惧されます。なので低分子量ペプチド用のポアサイズ0.22μmのPVDF膜を使用した方が良いかもしれません（もちろんこれとて保持できる限界はありますが）。ポアサイズ0.22μmのPVDF膜の場合、バックグラウンドは通常の膜と比べてどうしても高くなりますので、綺麗なデータが必要ならば、多めのタンパク質量をアプライして、短時間の露光でシグナルが見えるような工夫なども検討ください。

(無題) 削除/引用 No.12223-10 - 2024/03/16 (土) 01:04:51 - おお >[Re:5] Nさんは書きました : > トリストリシン系の場合Western blotはそのままトリスグリシン系と同じ感覚というか条件で行って大丈夫なのでしょうか。 一応論文をではバッファー置換をすることになってますが、トリスグリシン毛糸同じようにやってもだいじょうぶです。 心配なのは、トリスグリシンで従来上手くいくはずが分離できてないので、試薬、ストック溶液などで何かおかしい事が起こってそうなので、それなら、バッファーを変えたと事で改善しないかもです。。。。

(無題) 削除/引用 No.12223-9 - 2024/03/15 (金) 07:01:59 - おお もう一つ。 Tris Glycine でやるなら、分離ゲルのTris bufferの濃度を上げてみてください。そうすると低分子での分離能があがります。６００mMぐらいでいいかと。もっと短いオリゴペプチドなら倍（７５０mM）ぐらいまで上げることがあるがあげると徐々に高分子がわが詰まってそのあたりのレーンが膨らみだす（まあそこは関係ないことも多いでしょうけど）。ゲルの濃度は１５％でいいと思いますが、、、場合によってはBisの濃度をあげる場合もありますけど。 >17%でやってみましたが、15%大差なく、10 kDaまで分離できませんでした。 なにかがおかしいと思います。１２％もあればかろうじて分離できそうです。１０kDaまでみればいいなら１３．５％を使うことも個人的にはあります。１７とか１８なら３から５kDaくらいまで見れるのではとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.12223-8 - 2024/03/15 (金) 03:01:13 - おお プレキャストゲルではMES BufferとかでTricineほどでないけど低分子領域の分解能が上がるようです（自作も可能なのでは？）。またTris aspartic acidでTrisより若干低分子側が見やすいというような商品も見たことがある。

(無題) 削除/引用 No.12223-7 - 2024/03/15 (金) 01:42:29 - おお >[Re:4] っｇさんは書きました : > Tris-Tricineゲルに一票。 Me too.

(無題) 削除/引用 No.12223-6 - 2024/03/14 (木) 21:30:03 - 独り言 数kDaのタンパク質をよくTris-Tricineで泳動してました。 Tris-Tricineはいくつかプロトコールがあるかもしれませんが、 基本的には、泳動のバッファーとゲルの組成を変更すれば、 同じ泳動槽などの機器で、トランスファーからは同じバッファーでできたはずです。 なので、一度系を立ち上げてしまえば、簡単にできます。

(無題) 削除/引用 No.12223-5 - 2024/03/14 (木) 21:19:40 - N 17%でやってみましたが、15%大差なく、10 kDaまで分離できませんでした。 トリストリシン系はやったことないので、できるだけ避けたいなと思っていましたが、実際問題解決が一番早そうですね。 トリストリシン系の場合Western blotはそのままトリスグリシン系と同じ感覚というか条件で行って大丈夫なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12223-4 - 2024/03/14 (木) 20:34:36 - っｇ Tris-Tricineゲルに一票。 Tris-Glycineの高濃度ゲルより断然分離がいい。

(無題) 削除/引用 No.12223-3 - 2024/03/14 (木) 20:12:03 - 774R 私の経験では、10kDaのバンドを分離したければTris-Tricine（またはTaurine）の泳動バッファーを使わないと無理だと思います。Tris-Glycineでゲルを固くしたのとは雲泥の差ですよ。。 うろ覚えだけど、pKaの関係でGlycineは移動度が遅く、低分子のタンパク質と重なってしまうとかだった気がしますが、間違ってたらどなたか訂正してください。

(無題) 削除/引用 No.12223-2 - 2024/03/14 (木) 18:02:10 - K 普通にゲル化してるならAPSをはじめゲル作成のせいではないです。あまりないことですがAPSが本当にダメならばゲル化しません。 15%でも良いと思いますが、16とか16.5%とかの方がより良いかもしれません。特に注意点ないです。ゲルが固まる際にちょっと暖かくなると思いますが気にしなくていいです。 泳動では、あまり下まで泳動せず、有色分子量マーカーを見て、自分のみたいものの分子量がゲルの真ん中よりちょっと下くらいに来たら終了してください。それだけでも多分、だいぶ違うと思います。真面目にあまり下の方まで流してると低分子量のタンパク質は泳動中にゆっくり拡散するのでどうしてもボーっとしてきます Tris-tricine系 bufferによるSDS-PAGEという方法もあり、10KDa以下のpeptideの分離に優れているということで今でも時々使われていますが、私自身は人が言うほどありがたみなかった（多少はマシかなくらい）です。

sds-pageゲル　分離ゲル高濃度 削除/引用 No.12223-1 - 2024/03/14 (木) 17:40:38 - N 10 Kdaの分子が見たくて分離ゲル15%の自作のゲルでsds-pageしていますが、微妙に低分子の分解能が足りてないです。 �@AMPSの劣化での分解能の低下は考えられますか？他の試薬による影響もあるかもしれませんが、全部作り直すのはめんどくさいですw �A15%より高い分離ゲルを作ったことがないですが、何か注意点等ありますでしょうか？文献によると気泡が入りやすい？等あるらしいのですが…今回は17-18%でやってみようと考えています。

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