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(無題) 削除/引用 No.12216-9 - 2024/03/13 (水) 05:08:35 - おお >[Re:7] おおさんは書きました : > ニックとか入っていても大腸菌に入れて精製し直したらもとのプラスミドが取れることが大抵で、 念の為複数のクローンを拾っておくことも対策の一つです。

(無題) 削除/引用 No.12216-8 - 2024/03/12 (火) 16:13:16 - jjj plasmidを増幅、精製した後で、Vector Map見てまずは制限酵素処理してインサート切り出して電気泳動して、コンストラクト自体に何か問題ないかどうか(チューブのラベルと違うコンストラクトではないかも含めてわかるので）は確認することですね。コンタミも含めて、元々意図したものと違う、よくわからないものが増えてしまっていることも可能性としては高くないながらもたまにあります。 コンストラクトが問題ないことが確認できたら、あとTansfection以降の問題になりますが、transfectionの成否は、細胞とTransfection試薬の間のマッチングが重要な要因で、しばしば細胞と試薬の間の合う合わないがあるので、複数のメーカーの試薬で検討した方が良いですね。（小容量の無料サンプルもよく見かけるので探してみてください）transfection後のタイムコースも見るべきで、12, 24, 48, 72時間後とかでサンプリングしてwestern blottingして、蛋白質レベルでの発現のおおよそのピークを把握することも必要ですね。発現の時間的変化は遺伝子それぞれでちうので、あなたのみたいものがどんな感じかは以降の実験をデザインする上でも知っておく必要があります。 あとwestern blottingで使っている抗体は大丈夫でしょうか。あなたのみたいタンパク質が確実に存在するサンプル（positive control)できちんと反応するかどうかもチェックした方が良いですね。 以上の点をstep by stepでチェックしていくことで、原因は絞り込めると思います。

(無題) 削除/引用 No.12216-7 - 2024/03/12 (火) 10:22:16 - おお 精製度がよければ４度でも１０年ものでもワークしてます。ちなみにQiagenのカラムも実際はそんなにきれいでないらしい（保存にどれほど影響するかはわかりませんが）。 ニックとか入っていても大腸菌に入れて精製し直したらもとのプラスミドが取れることが大抵で、それでもワークしないならそのプラスミドが違うものであったり、Transfectionがうまく行ってない可能性もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.12216-6 - 2024/03/12 (火) 02:04:11 - めんちん >増幅、精製をキットを使って行った後にDNAの確認（ベクターDNAを制限酵素で切って電気泳動）をしない人をみることがあるのですが、トピ主様はそこの確認はされてるでしょうか？ ここはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.12216-5 - 2024/03/12 (火) 01:25:02 - Costae めんちん様、SYBR master様 コメントありがとうございます。 保管されていたプラスミドを用いて、大腸菌でトランスフォーメーション、培養・精製をし、ピュアなプラスミドを用いましたが、うまくいきませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12216-4 - 2024/03/11 (月) 23:49:37 - SYBR master あ、書くの忘れてましたが、ぶつ(plasmid)はほぼ25年位前の物です。

(無題) 削除/引用 No.12216-3 - 2024/03/11 (月) 23:46:30 - SYBR master >[Re:1] Costaeさんは書きました : > 大体、20年前から-20℃のフリーザーで保管されています。 > 今まで、何度解凍されたかは不明ですが多くて数回程度であると思われます。 > 精製された微量（5μl程度,濃度不明）のプラスミドを1.5mlチューブにそのまま分注したと思われます。 たまたまなのですが、塩化セシウムの超遠心で精製したplasmid(いやー古いねぇー精製方法が)有りまして、たぶん解凍は十数回は行われていると思われます。で、濃度は100ng/uLで-20度以下(ほぼ-30度)で保存していた物を、最近電気泳動で未処理で確認したのですが、70%以上が閉環状ではなく、ほぼニックが入ったopen circular状態でした。ちなみに直鎖のモノは観察されませんでした。 このことから考えると、いきなり培養細胞とかに古くから保存したplasmidを使用してtransfectionする前に、一度大腸菌に入れて、新たにキレイなplasmidを取って、実験してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12216-2 - 2024/03/11 (月) 23:44:17 - めんちん >長期保管したプラスミドがワークしなかったといった経験がありますでしょうか ワークしなかったというか、発現量が下がったことはあります。長期といわず、3ヶ月程度でも発現量が落ちたことがあります。調整されたばかりのDNAを細胞(HEK293）にトランスフェクションした場合の発現量を100とすると、そのDNAを半年後にトランスフェクションした場合に発現量が70-80になる感じです。 保存はデフロスト無しの-20Cで、あるいはMaxiで増やしたものを分注して-80Cで行っていますが、どちらでも発現量が落ちてました。 理屈上はそんなこと起る訳が無いと仰る方もいますが、実際に何度やっても落ちる傾向がみられるのだから仕方が無い。ベクターDNAを溶かすのにTEを使っているのをEDTAだけにしてみたり純水だけにしてみたりで試してみましたが、やっぱり落ちます。 なので、ここ一番で強い発現量が欲しい場合は、 >プラスミドを再度、増幅・精製し てます。トピ主さんはこれをやって、それでも発現しないという話なんですよね？その経験は無いです。増幅、精製というのは、ベクターDNAをトランスフォーメーションするところからやり直したという理解であってますか？それで発現しないなら、DNAの増幅、精製が上手くいって無いのでは？ たまに、増幅、精製をキットを使って行った後にDNAの確認（ベクターDNAを制限酵素で切って電気泳動）をしない人をみることがあるのですが、トピ主様はそこの確認はされてるでしょうか？

プラスミドの長期保管 削除/引用 No.12216-1 - 2024/03/11 (月) 23:11:42 - Costae 初学者です。 昔、ラボで作成し保管されていたプラスミドを再度、増幅・精製し細胞にトランスフェクションをして、WBで発現を確認するという実験をしていますがうまくいきません。 皆さまは、長期保管したプラスミドがワークしなかったといった経験がありますでしょうか。 コメントしていただけると幸いです。 大体、20年前から-20℃のフリーザーで保管されています。 今まで、何度解凍されたかは不明ですが多くて数回程度であると思われます。 精製された微量（5μl程度,濃度不明）のプラスミドを1.5mlチューブにそのまま分注したと思われます。

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