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(無題) 削除/引用 No.12213-11 - 2024/03/11 (月) 15:41:22 - おお 膜タンパクならPLP 固定っていうのがあるけどどうだろう。

(無題) 削除/引用 No.12213-10 - 2024/03/11 (月) 13:18:23 - μkぉp 抗体の認識するエピトープの位置や特性次第なので、うまくいくかどうかはわからないですが、未固定のままコンパウンドで凍結して（未固定凍結切片）、薄切後、PFAで5分程度、もしくは有機溶媒で−２０℃で10分程度固定して免疫染色するとかは一つの手だと思います。固定後に、PBSなどで切片を洗ってから、抗原賦活処理（方法は何通りかありますが、酵素処理は勧めません）してみることも有効かもしれません。抗原賦活処理を予定している場合は必ず剥離防止スライドグラスを使用してください。でないと切片は全部剥がれます。膜タンパク質ということなので、エピトープが膜貫通領域内とか近傍だと、特にPFA固定では難しいかもしれません。 こればかりはできないものはできないので、いくら時間かけて検討してもどうかと思うので、見切りつけて、組織染色可能な抗体に変える方が得策と思います。

(無題) 削除/引用 No.12213-9 - 2024/03/11 (月) 09:59:34 - TG 基本事項の確認としての質問ですが、モノクロですか、ポリクロですか？免役源はリコンビナントタンパクですか、それともペプチドですか？また、モノクロならスクリーニング方法はどうしましたか、ポリクロならアフィニティー精製はしていますか？

(無題) 削除/引用 No.12213-8 - 2024/03/11 (月) 07:03:27 - Y あのさん 細胞外ドメインを免疫原に用いていますのでフローサイトメトリーに使えたら良かったのですが残念です。

(無題) 削除/引用 No.12213-7 - 2024/03/10 (日) 19:18:02 - あの ちなみに、その抗体は、ターゲットとする膜タンパクの細胞外領域に対するものですか？ それとも細胞内領域ですか？

(無題) 削除/引用 No.12213-6 - 2024/03/10 (日) 18:18:25 - Y 皆様、 たくさんのコメントをいただきまして、ありがとうございました。 抗原賦活化はFFPEの染色時にはよく行っていましたが、凍結ではどうか、というのを私の問いに含んでいました。 ただ、凍結切片でも剥がれないように注意すれば、あり、とのこと、とても勇気づけられました。 ありがとうございます。 まずは行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.12213-5 - 2024/03/10 (日) 18:01:34 - 独り言 組織染色の場合は、抗原賦活化をよくつかします。抗原賦活化しないと染まらない抗体は、よくあります。 抗原賦活化は前述のプロテアーゼ処理や、熱処理、ｐHによる処理などいくつかあり、抗体によって、どれがベスト変わります。のでできる限りの条件で染色条件を決めるのが一番。 抗原賦活化の方法は、検索すればたくさんでてきます。 ただ、パラフィン切片がメインに使われている方法なので、凍結の場合は、スライドから切片がはがれないように気を付けないといけません。ただ、方法としては凍結切片でも全然ありです。

(無題) 削除/引用 No.12213-4 - 2024/03/10 (日) 13:47:35 - おお >[Re:2] あのさんは書きました : > コラゲナーゼだと強すぎるので、アキュターぜの方が無難かもしれません。 > > 参考になれば幸いです。 マトリックス成分を壊すということではないでしょうけど、強いプロテアーゼを使うこともありますねTrypsin、PepsinとかProteinase Kなど。Abcamはそういうのをキットで出してるようです。 そのほか電子レンジ、炊飯器、オートクレーブといったものを使ったりも。 https://www.abcam.com/protocols/ihc-antigen-retrieval-protocol その他ケミカルなども https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/002215549704500301

(無題) 削除/引用 No.12213-3 - 2024/03/10 (日) 12:41:52 - G25 変性状態でないとエピトープが露出しないのでしょう。 抗原賦活化の手法がいろいろありますので試してみては。 「抗原活性化」で検索したら見つかります。

(無題) 削除/引用 No.12213-2 - 2024/03/10 (日) 06:26:32 - あの もし細胞外マトリックスのせいで、抗体がターゲットに到達していなさそうなときには、 コラゲナーゼや、アキュターぜを凍結切片に用いて、成功した経験はあります。 コラゲナーゼだと強すぎるので、アキュターぜの方が無難かもしれません。 参考になれば幸いです。

ウエスタンに使用可能な抗体を組織染色に 削除/引用 No.12213-1 - 2024/03/10 (日) 06:11:55 - Y お世話になります。 ある膜タンパク質への抗体を自作しましたが、フローサイトメトリーには使えませんでした。 ただウエスタンには使用可能でした。 この抗体をPFA固定した組織を染められるか調べたところ、不可能でした。 どうにか凍結切片やホールマウント組織を染められるよう、組織側に工夫ができればと思いますが、立体構造を壊すような処理として、どのような方法がやられますでしょうか？ コメントいただけましたら幸いです。

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