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(無題) 削除/引用 No.12209-7 - 2024/03/10 (日) 21:57:08 - 774R どうでもいいけど、「募集」だと、相手が「応募」する関係になる。 教えを乞う側は「募集」しないほうが良いと思われ。

(無題) 削除/引用 No.12209-6 - 2024/03/09 (土) 16:32:47 - AA ・より短いインサートなら同じオーバーラップ領域を使ってもうまくいくのかどうか？ ・コンピテントセルの効率は十分に高いか？ ・切り出し精製などの手順があるなら紫外線を当てすぎていないか？ といったあたりでしょうか。 オーバーラップ領域に問題ないならコンピかなというきはします。

プラスミド作りのコツ 削除/引用 No.12209-5 - 2024/03/09 (土) 10:16:41 - DNA 昔たくさんのプラスミドを作りました。 あまり理論的ではないのですが、インサート部分、ベクター部分の酵素カットをする反応時間を長くすると大抵うまくいった記憶があります。 1時間なら4，5時間、3時間ならオーバーナイトといったように反応時間を延ばしました。ただ、反応液が少なくならないようにチューブの蓋をしっかり閉めて行いました。

(無題) 削除/引用 No.12209-4 - 2024/03/08 (金) 12:35:54 - G25 まず、同様のことを他のインサートでやって成功した経験はあるかどうか。 それとも全く初めての実験ですか。 前者なら、インサートが毒性（leaky epressionした産物が大腸菌に有害、複製を阻害するような配列など）なのかもしれません。 後者なら、In-Fusionのキットにポジコン用のインサートとベクターがあるはずだから、それで手技を検証してみましょう。

(無題) 削除/引用 No.12209-3 - 2024/03/08 (金) 08:06:57 - ExoIII コンピテントセルの効率は十分ですか？ In-Fusionのキットにコントロールのベクターとインサートが含まれていますので、まずはそれがきちんと動くか確かめてみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.12209-2 - 2024/03/08 (金) 03:50:05 - おお Competency -You could get several colonies by transformation of linear plasmids when you use good competent cells. E coli strain -Sometimes,you would get better results by changing strain without clear reasons. Gel purification of PCR fragments. -Although not detectable, by-products of PCR could disturb in-fusion or ligation process. PCR stringency and cycles -To get less by-products.

プラスミド作りの”コツ”募集中 削除/引用 No.12209-1 - 2024/03/07 (木) 15:18:23 - 初心者 本フォーラムで様々なことを学ばせていただいております。 現在、インサート3.6kbp、ベクター3.5kbpのプラスミドを作出中です。 PCRまでは問題ないことを電気泳動で確認しておりますが、 その後のIn fusion反応およびトランスフォーメーションが上手く働かず、 コロニーが生えてこない状況です。 表題の通り、プラスミド作りのコツ、気を付けていることなど 皆さまの知っていることを教えていただきたいです。 下記に情報を記載しておきます。 プライマー オーバーラップ領域15bpを持つように設計済み、配列に問題なし トランスフォーメーション ハウスメイドのコンピテントセルを使用 In fusion産物：2 µL使用

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