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(無題) 削除/引用 No.12206-7 - 2024/03/12 (火) 02:35:12 - めんちん qq様、おお様、TG様、gbhんj様、返信ありがとうございました。 >tissue lysateそのままだと、非特異的バンドが多過ぎてデータにならなかったです と書きましたが、やっぱり非特異的なものにもくっつく可能性が高いということですね。単純に抗His-tag抗体でIPをしても非特異的なものも一緒に落としてくる可能性が高そうという話に納得しました。 多段階の精製を試そうと思います。今のところ、ニッケルカラムでの精製後に抗Anti His-tag抗体でIPしようと考えています。抗体は、ThermoのC末His-tag抗体も買って試してみる予定です。 引き続きなにかしらアイデアがありましたらよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.12206-6 - 2024/03/08 (金) 02:08:04 - おお 後で詳しく書けるかもしれないが、C 末His tag特異的とかそういう抗体があったはず。そういうのであれば、特異性が高くなる可能性はなくなない。

(無題) 削除/引用 No.12206-5 - 2024/03/07 (木) 16:35:11 - 　gbhんj 普通の動物組織とか、細胞のライゼーとをサンプルにしてHis-tag抗体でwestern blottingしてみるとわかると思いますが、けっこう色々なタンパク質と反応します。実際、Histidine残基がクラスターみたいに集まってるような配列を持つタンパク質はわりとあるようですのでそういう結果はおかしくないのですが。不思議なことに大腸菌はあまりそういうタンパク質は多くないみたいで、His-tagタンパク質はいい感じの純度で精製できます。 なので、動物組織や細胞からですとどのくらい高度に精製することは難しいです。特にHi-tagタンパク質の発現量がそれほど高くない場合は、バックグラウンドとなる上記のような内在性のHistidine rich 配列をもつタンパク質に埋もれて識別できないかもしれません。anti-6xHis abによるアフィニティー精製に加えて他の精製法も組み合わせて数段階で精製する必要があるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.12206-4 - 2024/03/07 (木) 12:49:52 - TG anti-His抗体のアフィニティー・特異性も重要だけど、そもそも非変性条件下でHis-tagは抗体が結合可能な形でエピトープが露出しているのかな？トランスフェクタントからのIPで確認しているの？

(無題) 削除/引用 No.12206-3 - 2024/03/07 (木) 09:17:51 - おお なぜ抗体が違うとできないとお考えなのかよくわかりませんが、お示しの抗体はどちらともIP可能な抗体（カタログによると）なのでビーズが変わったら同様のサンプルでできないということはほぼないです。 心配するとすれば、Anti-HisTagで特異性が優れている抗体に出会ったことがありません。お示しの抗体は使ったことがないですが、MAB050のほうは彼らのデーターでHEKでノンスペが出てませんし印象はいいです（発現が強いだけかもしれませんが）。 IPにも検出限界みたいなものがあるので（ターゲットの量が少なくて、回収すれば検出できるけど回収できないとか）まあやってみないとわからないといえばそうです。あまり芳しくないようなら、Ni-beadsでEnrichmentしてからIPという手はなくはないです。マウスやヒトの細胞はHisが数個並んでいる蛋白が意外とあります。なのでNi-beadsにいろんな蛋白がつくにはつきます。Hisストレッチはないけどアルブミンは結合するという話もあります。なのでNi-beads単独では厳しいのではないかと思ってます。 加えて、Lysisのバッファーもそれぞれの抗体との相性があるので確認しておいたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12206-2 - 2024/03/07 (木) 07:59:06 - qq やったことないけど、 Dynabeads His-Tag Isolation ＆ Pulldown の方がいいんじゃない？

マウスtissue lysateからhis-tag付きタンパクを免疫沈降出来る？ 削除/引用 No.12206-1 - 2024/03/07 (木) 07:54:12 - めんちん マウスにHydrodynamic Gene Deliveryで各組織（主に肝臓）にHis-tag付きタンパクを強制発現させました。このマウスの組織のtissue lysate（in RIPA Buffer)を持っています。ここから、His-tag付きタンパクを抽出したいです。これは抗His-tag抗体とtissu lysate、Dynabeadsを使った免疫沈降で可能でしょうか？ 過去に、肺組織で発現しているあるタンパクを、肺組織のtissue lysateからDynabeadsを使った免疫沈降で落としてきたことがあります。tissue lysateとタンパクに対する抗体を4Cで一晩混和させた後にDynabeadとミックスして室温15分混和、Dynabeadsを洗って最後にpH=2.2のElution Bufferで溶出しました。これは上手くいって、免疫沈降に使ったのと同じ抗体でIP-WBをすると綺麗なバンドを検出することが出来ました(tissue lysateそのままだと、非特異的バンドが多過ぎてデータにならなかったです）。 His-tag付きタンパクを抽出したいので、上記の免疫沈降の抗体を抗His-tag抗体に変えて同様のことをすれば良いだけに思うのですが、「Anti His-tag antibody」と「Dynabeads」などのキーワードで検索しても上手く見つかりません。過去にHis-tag付きタンパクを扱ったことが無いので、もしかしたら私はとんでもない見過ごしをしていたりするのではないかと心配になってきました。 「抗His tag抗体とDynabeadsを用いて、マウスのtissue lysateからhis tag付き抗体を免疫沈降する」のは可能か否か、経験がある方おられたらお話聞かせて頂けますか？よろしくお願い致します。 抗His tag抗体はラボに二つあって、一つはCell Signaling Technology社の#2365で、もう一つはR&D社のMAB050です。

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