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(無題) 削除/引用 No.12201-4 - 2024/03/06 (水) 03:48:20 - おお ばらつきに関してはその実験やシグナル固有のものもあるだろうし、細胞が違うだけでも変わってくる事があるだろうから、一般化してこうすればいいということは難しいと思いますが、、、特定の実験でこうしたら良かったという話は経験者に譲るとします。 まだよくわからないのですがAの下流にCがあり、Aを阻害してもBの経路からCに到達しているというスキームなのか、Aの下流にはCがないのにCが脱リン化されるのでBの経路がAからのクロストークで活性化していると考えているのかです。この辺の大前提を最初に整理しておかないと思っていた事と違う回答が来てしまいます。 なので今回もどの仮定で進めているかわからない状態ですが、前者の仮定で書いています。で更に仮定を加えないといけませんCはAの刺激前にリン酸化が顕著に現れてますか？現れているとしますね。 この状況でA経路を活性化するとCの脱リン酸化が見られる。ここでちょっと妙な感じがします。なぜリカバリーが必要なのかです。リカバリーしなくてもCが脱リン化していればそれでいいはずです。それとも上記で指摘したように刺激前にはCはリン酸化してないのですか？それもちょっと妙です。いずれにしろCのリン酸化が亢進した状態を作り、そのうえで実験したほうが良さそうな気がします。例えばB経路が活性化される最上流はなんですか？そこをブロックしておけば内在性のB経路からのCの脱リン酸化は最小に抑えられるかもしれません。 刺激と同時に阻害剤を入れる場合、もしかしたら刺激からシグナルが発生するタイミングと薬剤が浸透して実際に阻害し始めるタイミングが同時でないため、微妙なタイミングの差がばらつきに反映されているかもしれません。そういう観点から阻害剤の前処理でCの脱リン酸化がないのはB経路は関与していない可能性を示唆しているとも言えます。 いずれにしろもう少し情報がないとこれといったことは言いにくいです。

(無題) 削除/引用 No.12201-3 - 2024/03/05 (火) 19:54:39 - p 仮説ですが、少しちがいます。刺激により一見独立の経路Aと経路Bが活性化しますが、活性化したAからBにクロストーク（促進）があるため、経路Aを阻害すると経路Bの活性化が減少し、Cのリン酸化も減るというものです。 Aの阻害剤で一度はCのリン酸化減少が見られたのには、なんらかの理由があると思うのですが、以後それが再現できません。阻害剤実験で結果がぶれた経験者もおられるかと思いますが、そのときどのように解決されたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12201-2 - 2024/03/05 (火) 03:06:40 - おお A経路を阻害しても、AからのクロストークでB経路からCをリン酸化がおこるだろうというのが質問者の仮説でしょうか？ ならばリン酸化されているようです。刺激なしの何らかのコントロールがほしいところですが。 ＞今度は阻害剤の前処理あり（２時間）で２回同じ実験をすると、Cのリン酸化は２回とも減りませんでした。 これがわりかしうまく行っているように見えますが、全く減らないのが気持ち悪いということでしょうか？なら前処理を短くしてみれはと思います。もしかしたらA経路の阻害が何らかのシグナルになってB経路が亢進したかもしれませんね。そのあたりも探れればいいかもしれません。あるいはA経路とA経路のクロストークで活性化されるB経路の下流の阻害剤を使えば、その低下しないリン酸化の原因はB経路のものであるという裏が取れますよね。 ＞１、２、３回の実験で、1.５割、５割、０割減っていました。 力ずくで実験回数を増やすというのはできなくもないですね。いずれにしろCがリン酸化しているし、それがベースラインより高いことが示せるのなら仮説に対してSuggestiveなデーターではありますから。ただ経路Aのいろいろなところで阻害をかけてとなると、このばらつきはちょっと厄介かもしれません。

リン酸化経路のクロストーク 削除/引用 No.12201-1 - 2024/03/05 (火) 02:04:27 - p 刺激後のシグナル伝達経路Aと経路Bのクロストークを調べているのですが、 経路Aの阻害剤で処理した細胞では、経路Bで最下流の蛋白質Cのリン酸化が、 １、２、３回の実験で、1.５割、５割、０割減っていました。 バラツキが大きくなった原因がわからず困っています。 阻害剤処理は前処理なし（刺激中、刺激後のリカバリー期間のみ阻害剤処理）で行いました。 リカバリー後（リカバリーがCのリン酸化に必要なため）、細胞にSDSサンプルバッファーを直接加えて即時溶解しています。 さらに、今度は阻害剤の前処理あり（２時間）で２回同じ実験をすると、Cのリン酸化は２回とも減りませんでした。 すべての実験において阻害剤が効いていることと、 経路Aをより上流で阻害するとCのリン酸化が減ることは、確かめていますが、経路Aのどのレベルでクロトークが起きているのかに興味があります。 今回用いた阻害剤の標的におけるクロストークの有無に関して早期に結論を得たいのですが、どのような条件で実験するのが良いと思われますか？

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