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(無題) 削除/引用 No.122-6 - 2012/02/08 (水) 23:00:17 - U 皆様どうも有難うございます。 ７７４４さん Negative selectionのkitの場合は、lineageマーカー陽性細胞を除去できても、lineageマーカーを発現していない造血幹細胞、前駆細胞がB細胞と一緒にnegative fractionに残る可能性を危惧しておりました。CD43抗体を含めたカクテルでnon-B lineageの細胞を除去する製品を用いて造血幹細胞、前駆細胞を除去できるかどうかは、CD43の発現レベル（勉強不足で知りませんでした）によると思われるので、調べてみたところ、マウス造血幹細胞でのCD43の発現が報告されている事が分かりました。よって、CD43抗体を含むnegative selectionは造血幹細胞、前駆細胞を除去できる可能性が高いと思われますので、トライしてみたいと思います。どうも有難うございました。 免疫さん 御指摘の点（in vivoとin vitroの違い）は重要で、専門の方の御意見をここで伺えると有り難いと思っておりました。抗体療法のin vivoでの効果が、補体やeffector細胞を介した細胞死で完全に説明されるのかどうか、勉強不足で知りませんでした。昔の論文ではRituximabのdirect effectによりin vitroでapoptosisが誘導されるとの報告も見られるのですが、この点については結論が既に得られている（少なくともRituximabの場合はdirect effectではなく、主にCDC/ADCCを介した細胞死でその効果が誘導される）との理解でよろしいでしょうか？　その場合は、B220ビーズでのpositive selectionも問題ない（マクロファージ他effector細胞の混入がない事が条件ですが）と思われるので、negative selectionがうまく行かない場合には検討してみます。どうも有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.122-5 - 2012/02/06 (月) 20:22:43 - 免疫さん 僕も、Uさんのおっしゃる「抗体の影響」というものがイマイチピンときません。 具体的にCD45R抗体やCD19抗体などがUさんのアッセイにどのような影響を与えると想定されるのでしょうか？。使用する抗体が誘導するシグナル、あるいはリガンド結合阻害が直接影響を与えると考えられる系を用いる場合には、もちろん該当する抗体の使用は避けるべきでしょう。 毒性という表現を用いられてもいますが、もしかして死ぬか生きるかという点を問うておられますでしょうか？。そういうことならば、どの抗体を利用しても大きな問題なく生きます。CD45RやCD19は特に細胞死を誘導するものではありません。 CD20抗体治療の話は恐らく主としてCDCやADCCの誘導によるものですから、分取後のB細胞を使用する段においてはほとんど関係致しません。 それでも心配でしたら、7744さんの提示されたネガティブsort用のキットを利用されてはと思います。

(無題) 削除/引用 No.122-4 - 2012/02/06 (月) 18:20:06 - 7744 細かいことはよくわからなくてものを言うのは申し訳ないのですが、ミルテニーのB cell isolation kitはすでに検討されましたか？

(無題) 削除/引用 No.122-3 - 2012/02/06 (月) 13:42:18 - U トムソン様 お返事ありがとうございます｡ 説明が不十分で申し訳ありません｡ 少し具体的に説明すると､ とあるproto-oncogeneのconditional knock-inマウスを用いて､ B細胞系での変異標的となる細胞分画を同定したいと考えております（臨床的には成熟B細胞腫瘍で変異が同定されています）｡ Mx1Creの系で造血幹細胞および前駆細胞を標的にすると､ 100%骨髄球系の腫瘍となり､ B細胞系は骨髄レベルでdefectiveになります｡ このoncogeneがB細胞系腫瘍においてdriver oncogeneであるとの仮説に基づき､ in vitroでのCreERを介した変異誘導によりgrowth advantageを獲得するB細胞系の細胞集団を同定しようと試みています｡ Bulkのsplenocytesで試みると､ B細胞系のadvantageは微妙なのに対し､ 骨髄球系の細胞の増加が変異導入後１週間ほどで明らかになります｡ よって､造血幹細胞および骨髄球系の前駆細胞をかなりの純度で除去した上で､ B細胞を分離し培養したいと考えています｡ 当初は単純にB220磁気ビーズでのpositive selectionでいけると考えていたのですが､私自身は造血幹細胞および前駆細胞のソートでの分離培養の経験しかなく､ 特に成熟リンパ球の分離はpositiveよりnegative selectionの方が安全とのアドバイスをくれる同僚もいたりするので､ 特に成熟B細胞に対する毒性の観点で､ 抗体を用いたpositive selectionの安全性について皆様の御意見が伺えると幸いです｡ よろしくお願いします｡

(無題) 削除/引用 No.122-2 - 2012/02/05 (日) 14:53:29 - トムソン 有効な答えがパッと浮かびませんが、 貴方のおっしゃる「抗体の影響」とか「細胞の機能に影響を、、」というのは 具体的にどういう細胞機能・どういう影響を想定しておられますか？ 抗体を使ってソートする以上、細胞への影響が全くない方法などないと思うのですが。 現行のソート法で起こるどういう現象が問題となっているのかを挙げた方が答えが得やすくなるかと思います。

培養目的でのマウス脾臓B細胞分離法 削除/引用 No.122-1 - 2012/02/05 (日) 11:33:49 - U いつもお世話になっております｡ マウスの脾臓からBリンパ球を分離して培養実験に使いたいのですが､ 一般的なB細胞特異抗原に対する抗体を用いた磁気ビーズやソートでのpositive selectionでは､ 抗体のB細胞への結合がその後の培養に影響する可能性が予測されます｡ トータルの脾臓細胞を用いたpreliminaryの実験では､ T細胞の他に骨髄球系（もしくは多能性）前駆細胞の混入により実験結果が大きく修飾される可能性が示唆されており､ CD3+CD14(あるいはCD11b)でのnegative selectionではlineageマーカー陰性の前駆細胞の除去ができない点が問題になっております｡ この状況でどのような方法が可能か､ 皆様の御意見うかがえると幸いです｡ 特に､ (1)B細胞特異抗原の中で､ 抗体結合しても細胞の機能に影響を及ぼさない事が分かっているものが存在するのかどうか､ (2)前駆細胞マーカーでB細胞系では発現していないものが存在するのかどうか､ について教えてもらえると有難いです｡ 前者については､ 例えばB220陽性細胞を抗体で分離後培養した論文も散見されるのですが､ 抗体による影響を評価した上で実験された事が記載されているものが見つからず､ 実際CD20の抗体がリンパ腫の治療に用いられている事を考えると､ これらの論文を鵜呑みにして良いのかどうか､ 判断しかねております｡ 後者については手持ちの抗体で見れる範囲内については自分でも調べてみる予定ですが､ 少なくともc-kitはB細胞系での発現が知られており､ c-kit陰性のB細胞となると､ どのあたりからになるのか､ 細胞表面IgM陽性の時点で完全に細胞表面c-kitの消失が見られるのならば､ 使えなくも無いかなとも思っております｡ CD19-CreあるいはCD43-CreマウスとGFP-reporterマウスをかけてGFP陽性細胞をソートするのが一番確実なように思いますが､ できればTgマウスを購入せずに何とかしたいと思っております｡ よろしくお願いいたします｡

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