全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12199-9 - 2024/03/04 (月) 20:03:10 - SYBR master >[Re:1] folさんは書きました : > qPCRでターゲットよりもハウスキーピング遺伝子の方がバラツキが大きく、 > ΔΔCt法で正規化すると、ハウスキーピング遺伝子の差を見ているようになってしまうことがありますが、 > このような場合の対処法はありますでしょうか。 > 複数のハウスキーピング遺伝子で検討しても同様の結果です。 RT-qPCRでの遺伝子発現の比較において、RNAのRIN値が問題無いのにもかかわらず、「ハウスキーピング遺伝子の発現差」が顕著になるのは、異なる組織間を比べたり、同一処理を行ったけど異なった細胞株を比べるときですかね。細かい実験条件が開示されていないので、今回がそうであるかどうかは不明ですけど。 経験的にですが、組織や細胞株が異なると、「ハウスキーピング遺伝子」の発現量(Ct値)は結構な値で異なりますので、比較は難しくなります。昔、有る遺伝子の発現量を比較しようとした所、「ハウスキーピング遺伝子」で補正すると全ての遺伝子が、「精巣(testis)」だけで高くなったデータがあって、投入RNA量での補正で、reviewerに納得してもらったことがあります。 ちなみに、この「ハウスキーピング遺伝子」での補正は、ESやiPSで分化誘導をかけたときも、データがおかしくなりました。これについてはその後、論文になっていないので、その時どの様なデータ処理したかは、記憶の彼方ですが、たぶん「投入RNA量での補正」で行ったと思います。

(無題) 削除/引用 No.12199-8 - 2024/03/04 (月) 04:29:51 - おお ところでspike-inは受け入れられないのですか？

(無題) 削除/引用 No.12199-7 - 2024/03/04 (月) 04:27:39 - おお >[Re:6] folさんは書きました : > 皆様ご指摘ありがとうございます。 > > 今回のサンプルではRIN値まで測定していませんが、 > たまに必要があり測定する他サンプルのRIN値は８以上であり、 > 同じ方法で保管・抽出していますので、今回のサンプルもクオリティは問題ないと考えていました。 > いくつかのターゲット遺伝子についてはばらつきが少ない点からも支持されると思います。 意外とコンシスタントにRINが高いサンプルが取れるとは限らないです。過信は禁物です。ですからRinを測れという事がよく言われるのです。そうでなければそこまで重要視されません。 > > qPCRの限界も考えつつもう少し別のハウスキーピングも確認してみたいと思います。 違う可能性としてはサンプルがPCRを阻害するような物質を含んでいるかと言う事です。哺乳類細胞ではメラノーマ(メラノサイト)が有名ですが。

(無題) 削除/引用 No.12199-6 - 2024/03/02 (土) 11:22:01 - fol 皆様ご指摘ありがとうございます。 今回のサンプルではRIN値まで測定していませんが、 たまに必要があり測定する他サンプルのRIN値は８以上であり、 同じ方法で保管・抽出していますので、今回のサンプルもクオリティは問題ないと考えていました。 いくつかのターゲット遺伝子についてはばらつきが少ない点からも支持されると思います。 qPCRの限界も考えつつもう少し別のハウスキーピングも確認してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12199-5 - 2024/03/02 (土) 08:25:08 - おお あ、そうですね。複数のハウスキーピングでサンプル間で数値がばらつくならRNAのクオリティーをまずは疑ったほうがいいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12199-4 - 2024/03/02 (土) 03:57:38 - あああ ほとんどの場合RNAのクオリティが悪いのだと思います。 ハウスキーピングについて考察することはあまり有意義であるとは思いません。ラボ内で各組織毎に1-2個決めてしまってそれで固定で良いと思います。 βアクチン＋GAPDH＋α（組織特定的）があれば十分です。 それでもハウスキーピングの選択によって有意差が出たり出なかったり悩ましい場面もあります。 しかし、そもそもqPCRというのは全測定項目のうちの1つにしかすぎず、かつハウスキーピングの変更程度で多少結果が変わることがあるというのは読者は十分に理解しています。その場合は論文の結論や研究スタイルとの相談かと思います。

(無題) 削除/引用 No.12199-3 - 2024/03/02 (土) 00:41:54 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3091780/ https://academic.oup.com/biomethods/article/8/1/bpad034/7453376 Spike-in 試料のRNAにマイクログラムあたり一定量のRNA（試料にはないもの）を加えてRTqPCRをするとマイクログラムあたりのStandardizeができます。 miRNAでは適切な内部標準がなくよく使われるのでは？

(無題) 削除/引用 No.12199-2 - 2024/03/01 (金) 21:15:27 - あの 誤解がありそうです。 まずは、最適な内部コントロールをえらぶための、 Genorm とnormfinder で検索してみると、知識を改善できると思います。

qPCRの正規化 削除/引用 No.12199-1 - 2024/03/01 (金) 21:10:13 - fol 大変お世話になっております。 qPCRでターゲットよりもハウスキーピング遺伝子の方がバラツキが大きく、 ΔΔCt法で正規化すると、ハウスキーピング遺伝子の差を見ているようになってしまうことがありますが、 このような場合の対処法はありますでしょうか。 複数のハウスキーピング遺伝子で検討しても同様の結果です。 また、別の質問になってしまいますが、 ハウスキーピング遺伝子は、昔から決まったものを使っていて特に選択はしていないという方もいるように思いますが、 複数のハウスキーピング遺伝子を選択できる場合、どれを選択すべきかなどの基準はあるのでしょうか。 ハウスキーピングの選択で結果が変わることはよく経験し、どの結果を信じてよいのか分からないことがあります。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---