全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12194-11 - 2024/02/29 (木) 18:28:21 - 774R 蛇足ですが、RIPAの厳しい条件下でIPしたいとき限定ですが、細胞を溶かすときに最初に少量の1%SDSを用いることで回収漏れを防ぐと共に、相互作用の弱いcomplexを乖離させ、後に10倍量のTriton溶液を加えることでIP可能な溶液条件にする方法があります。（Triton溶液の追加は単にSDS濃度が低くするだけでなくSDSの作用を弱める作用がある。）

(無題) 削除/引用 No.12194-10 - 2024/02/28 (水) 23:59:46 - LPS 免沈が必要ない時は、直接、SDS lysis solを入れてます。

(無題) 削除/引用 No.12194-9 - 2024/02/28 (水) 19:38:14 - Bgふ inhibitor入れたほうが良いと思うけど、じゃあ、入れたから大丈夫がというそんな保証はないし、実験過程での脱リン酸化のリスクは減らせると思うけど。 脱りん酸化が起きてしまうならば、以下の方法が確実と思う。 細胞を直接、低温の10% TCAに懸濁（inhibitor不要）→氷中で30分ー1時間放置→遠心→冷acetoneで懸濁→−20℃で １−２時間放置→遠心→沈殿→少量のSDS Sample bufferに溶解（ pHが低ければ（ていうかまだ低いこと多い）微量の1MTris入れて、だいたい中性にする） 注：ただしPhospho Histidineの分析には使えません。

(無題) 削除/引用 No.12194-8 - 2024/02/28 (水) 19:37:38 - 独り言 Lysis buffer にphosphatase inhibitorはなくても見れるリン酸化はあるので、必須ではありません。 ただ、他の方もおっしゃる通り、入れておいた方が安心。

(無題) 削除/引用 No.12194-7 - 2024/02/28 (水) 14:05:22 - 774R 質問者さんが1%Triton Lysis buffer中で脱リン酸化反応が起きないと思った理由が全くの謎ですが便乗質問させてください。 いきなりSDS sample bufferで細胞を溶解させる時もPhosphatase inhibitorは必要でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12194-6 - 2024/02/28 (水) 13:25:11 - おお >[Re:3] Komomoさんは書きました : > >[Re:2] おおさんは書きました : > > Phosphatase Inhibitorなしで、あなたのターゲットのリン酸化が細胞での状態を維持していることを保証できるものがありますか？ > > どうなんでしょうか？いかんせん知識がないもので、わかりません。 だから入れるんでしょう？ > そもそもリン酸化修飾は抽出時に分解されるパターンが多いようで、培地を吸引後、すぐに液体窒素にdishごと凍結させるのが良いとどこかで聞いたことがあります。 多いか少ないかはわからないですが、分解されないだろうというパターンのものの方が馴染みがあります。 リン酸化の研究が注目され始めたころは、キナーゼの活性化などはダイナミックな変化があるので、ホスファターゼは、定常的に脱リン酸化をしているような感覚で研究が進められていたと思います。また、ホスファターゼは基質特異性に乏しく、ライセートでごちゃ混ぜになった状態で色々なリン酸化タンパクを脱リン酸化してもおかしくないとも思われます。 指摘にありますが、変性能力が(ほとんどの)ないLysis buffer で脱リン酸化活性はほぼアクティブなままです。

(無題) 削除/引用 No.12194-5 - 2024/02/28 (水) 13:10:59 - Komomo >[Re:4] TSさんは書きました : > そのあとその1%Tritonで溶かすつもりならいるんじゃないの？ > なんでいらないって思ってるの？ > Protease inihibitorは入れるのに？ 正直なところ、入れた方が良いと思っています。 関係ないとは思いますが、なぜ敬語が使えないのでしょうか？ 誰にでもそのような対応をするのであれば、変えた方が良いと私は思います。 正直に言いますと大変気分が悪いです。 こういう方には何を言っても無駄なのはわかっていますが... 投稿ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12194-4 - 2024/02/28 (水) 12:58:22 - TS そのあとその1%Tritonで溶かすつもりならいるんじゃないの？ なんでいらないって思ってるの？ Protease inihibitorは入れるのに？

(無題) 削除/引用 No.12194-3 - 2024/02/28 (水) 12:45:20 - Komomo >[Re:2] おおさんは書きました : > Phosphatase Inhibitorなしで、あなたのターゲットのリン酸化が細胞での状態を維持していることを保証できるものがありますか？ どうなんでしょうか？いかんせん知識がないもので、わかりません。 そもそもリン酸化修飾は抽出時に分解されるパターンが多いようで、培地を吸引後、すぐに液体窒素にdishごと凍結させるのが良いとどこかで聞いたことがあります。 その上でphosphatase inhibitorが必須なのかということです。

(無題) 削除/引用 No.12194-2 - 2024/02/28 (水) 12:28:22 - おお Phosphatase Inhibitorなしで、あなたのターゲットのリン酸化が細胞での状態を維持していることを保証できるものがありますか？

WBによるリン酸化タンパクレベルの測定 削除/引用 No.12194-1 - 2024/02/28 (水) 12:06:37 - Komomo WBでリン酸化レベルの測定をしようと研究計画を組んでいます。 私は、以前からタンパクの検出においては培養細胞から、1%Triton Lysis buffer に protease inhibitorを添加してタンパクを抽出しています。 リン酸化レベルを測定する場合には、Phosphatase Inhibitorの添加は必須でしょうか？

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---