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リン酸化ペプチド抗体 トピック削除
No.12189-TOPIC - 2024/02/24 (土) 07:10:00 - p
市販のリン酸化蛋白質に対する抗体についての質問です。
未刺激ではリン酸化されないはずなのに、泳動度がわずかに大きい位置に、ごく細いバンドが見えます。
これは、非リン酸化抗体を吸収除去できなかったバックグラウンドなのか、他の残基のリン酸とクロスしているのか、はたまた別の理由によるものなのでしょうか?
 
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(無題) 削除/引用
No.12189-7 - 2024/02/25 (日) 09:13:04 - p
その通り

(無題) 削除/引用
No.12189-6 - 2024/02/25 (日) 06:52:59 - 独り言
サンプルをフォスファターゼ処理してから、永動して、そのバンドが消えたらリン酸化ということになるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.12189-5 - 2024/02/24 (土) 19:05:27 - p
みなさま、アドバイスをありがとうございます。

抗体はポリクロ、培養細胞を用いています。
検出の2次抗体は蛍光標識したものを使っていて、ECLのようにシグナルを増幅しないのですが、
未刺激のサンプルでも刺激後の10-20%くらいのシグナルが見えたので、解釈に困っていました。
ただ、泳動度が微妙に違います。
別の抗体を使ってみて、バンドが消えるようであれば非リン酸化型を、見えるなら定常状態のリン酸化を見ていると解釈するのが妥当そうですね。

(無題) 削除/引用
No.12189-4 - 2024/02/24 (土) 15:12:27 - う
抗体はポリクロですかモノクロですか。
ポリクローナル抗体の場合、リン酸化アミノ酸部位を含んである範囲のペプチド配列を認識する抗体の他に、比率としては少ないですが、りん酸化アミノ酸部位を含まない周辺領域を認識する抗体も多少混じってることがあります。経験ですが前者の方が失活してくると後者の方が目立つ様になり、購入当初は刺激してリン酸化された時にのみシグナルが出ていたものが、抗体が古くなってくると刺激の有無に関係なくシグナルが出ることがありました。新たに買い直したら元に戻りました。

(無題) 削除/引用
No.12189-3 - 2024/02/24 (土) 10:34:09 - み
材料が培養細胞なのか組織なのか不明ですが、いずれにせよ生きている以上、何らかのシグナルが入って低レベルでリン酸化していても何もおかしくない。
外から叩いたらリン酸化が増強されるというのは極端に見やすくしたモデルとも言える。

10倍100倍検出力が良いリン酸化抗体を使用したり、pan抗体で濃縮しておいてリン酸化抗体でブロットしたりしたら定常状態でも充分なバンドが検出されるでしょう。

抗体特異性に疑問があるなら、抽出物を脱リン酸化酵素で処理して、バンドが減弱することを見ても良い。

(無題) 削除/引用
No.12189-2 - 2024/02/24 (土) 07:41:00 - おお
>未刺激ではリン酸化されないはずなのに

絶対にリン酸化フォームが0というはっきりとしたメカニズムがあるのでしょうか?未刺激のときに生化学的にそのキナーゼの活性を測ったら0だったとか、、、0だったかもしれないが、我々がやるような実験はたいてい0でなく検出限界以下ってことだからそれでも活性がないとは言い切れない。

それよりリン酸化がほとんどされないか、されても脱リン酸化活性のほうが強いのでごくわずかしかリン酸化フォームがなく、下流にシグナルを伝えるには十分ではないと思うほうが個人的にスッキリしますけど。細胞も何らかのものを分泌していてそれが弱いながらに刺激につながっているということもあるでしょう。


ただ示された可能性をふくめどのケースの可能性も否定できませんが、証明は難しいと思いますが、

色々文献を見ると良いでしょう、様々なリン酸化を促進する刺激前に弱いけどバンドが見えているようなデーターはそれなりにあります。

ただ、それを追求して実際どうなっているのか示すことが意義のあることという判断であれば、それは否定しませんが。

リン酸化ペプチド抗体 削除/引用
No.12189-1 - 2024/02/24 (土) 07:10:00 - p
市販のリン酸化蛋白質に対する抗体についての質問です。
未刺激ではリン酸化されないはずなのに、泳動度がわずかに大きい位置に、ごく細いバンドが見えます。
これは、非リン酸化抗体を吸収除去できなかったバックグラウンドなのか、他の残基のリン酸とクロスしているのか、はたまた別の理由によるものなのでしょうか?

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