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(無題) 削除/引用 No.12186-11 - 2024/02/24 (土) 16:28:42 - クッキー >[Re:10] montさん ありがとうございます！ぜひ参考にさせていただきます！

(無題) 削除/引用 No.12186-10 - 2024/02/24 (土) 02:44:20 - mont 私のプロトコールですが、参考にどうぞ。 https://benchling.com/s/prt-wskVzYVcG9M2NQLJTCTd?m=slm-eqbQjQTIGxPhAUANFBOz

(無題) 削除/引用 No.12186-9 - 2024/02/22 (木) 15:47:18 - クッキー >[Re:8] おおさん はい、増加しにくい株のようです。スケール調整も検討してみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12186-8 - 2024/02/22 (木) 15:31:17 - おお 温度はさほど重要でなく、増殖が行き過ぎないようにコントロールするためと聞いた事があるが。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/competent-cells-strains/mach1-competent-cells.html Dh5alpha は確かに遅いですね。コンピの分注する数にこだわりがないなら、菌の量に合わせてスケールを調整してもいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.12186-7 - 2024/02/22 (木) 15:16:19 - クッキー >[Re:6] 佐藤　裕美さん > 他の菌株より低温で増えにくいので、100倍希釈の本培養でOD600を0.4にするのに30〜32時間くらいかけています。 フラスコはバッフル付きです。 私が想定していた時間よりもかなり長い時間培養しているなという印象です。 焦りすぎていたかもしれません。気長に待ってみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12186-6 - 2024/02/22 (木) 13:27:48 - 佐藤　裕美 DH5aで18c培養してコンピテントセルを作っています。 他の菌株より低温で増えにくいので、100倍希釈の本培養でOD600を0.4にするのに30〜32時間くらいかけています。 うちでは夕方に本培養をはじめて、翌日夕方から作業です。 500mlのフラスコはバッフル付きを使っていますよね？

(無題) 削除/引用 No.12186-5 - 2024/02/22 (木) 12:36:16 - クッキー >[Re:4] qqさんは書きました : > SOBにMgCl2を入れ忘れていませんか？ > ご意見ありがとうございます。 オートクレーブ後、温度が下がってから、10mMの濃度で加えております。

(無題) 削除/引用 No.12186-4 - 2024/02/22 (木) 12:28:23 - qq SOBにMgCl2を入れ忘れていませんか？

(無題) 削除/引用 No.12186-3 - 2024/02/22 (木) 12:22:48 - クッキー >[Re:2] 774Rさんは書きました : > むしろ、18℃、16時間で増えると思った理由を教えてください。 18℃の設定はinoue法に従ったまでですが、16時間はO/Nとして一般的な長さだと考えたためです。 必要なODは0.6ほどで、16時間でそこまで増加しているとは考えておりませんでしたが、0.3ほどはあるかと考えました。 また、１時間後の増加率が0.01ほどなことに問題があるように思えてしまいます。 お答えになっているでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12186-2 - 2024/02/22 (木) 12:17:20 - 774R むしろ、18℃、16時間で増えると思った理由を教えてください。

DH5α株 Competent Cells作成方法について 削除/引用 No.12186-1 - 2024/02/22 (木) 12:15:40 - クッキー いつも拝見して勉強させて頂いております。ありがとうございます。 この度、Inoue法を用いて大腸菌DH5α株のCompetent Cellsの作成を試みたところ、全く増殖しないため相談させて頂きます。 グリセロールストックからLB固形培地にまき、 シングルコロニーをピックしてLB液体培地25mL(300mLフラスコ中)に入れて37℃ 240rpmで8時間培養しました。(この時点では培地が濁っており問題なく増殖していると思われます。) 次に前培養液5mLをSOB培地100mL(500mLフラスコ中)に入れて18℃ 240rpmで培養しました。 ここでOD600を測定したところ、16時間培養しても0.14ほどであり、その後１時間おきに測定しても0.01ずつしか増加しません。 ・無菌操作に関しては十分に注意しております。 ・培地はオートクレーブ済みであり、抗生物質無添加です。 何が原因として考えられるのかご助言いただけると幸いです。よろしくお願いいたします。

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